趙秀平, 李國瑞, 王 雙, 閆星伊, 段 強(qiáng), 張 帥, 風(fēng) 蘭, 韓雯毓, 孫佳欣, 陳永勝

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)與食品學(xué)院, 內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心, 內(nèi)蒙古自治區(qū)蓖麻育種重點實驗室, 內(nèi)蒙古自治區(qū)蓖麻產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心, 蓖麻產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新內(nèi)蒙古自治區(qū)工程研究中心, 內(nèi)蒙古 通遼 028043)

【研究意義】稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)是可寄生在包括水稻、小麥、小米等多種經(jīng)濟(jì)作物在內(nèi)的50多種禾本科植物上的一種絲狀子囊菌，可引發(fā)植株患稻瘟病，導(dǎo)致作物大幅度減產(chǎn)，嚴(yán)重影響作物品質(zhì)和產(chǎn)量[1-2]。其因具有典型的絲狀病菌特征，已被作為研究絲狀病菌的模式生物[3]。MSP1(MagnaportheoryzaeSnodProt1 )是稻瘟病菌MGG-05344基因編碼的與稻瘟病菌的植物毒性相關(guān)的SnodProt1蛋白。Jeong Jun Seop等人的研究表明，MSP1的突變不改變稻瘟病菌的表型，但會導(dǎo)致稻瘟病菌的毒性顯著降低，這是首次表明該蛋白與植物毒性相關(guān)[4]。【前人研究進(jìn)展】Snodprot1，首次于小麥病原體中鑒定，是真菌特異性小分泌蛋白家族的成員，該家族成員均具有植物毒性[5-6]。Cerato-platanin是Snodprot1的同系物，該家族蛋白(Cerato-platanin family proteins, CPPs)只存在于真菌中。CPPs主要編碼105～134個氨基酸，含有1個14～18個氨基酸殘基的信號肽，含有可形成2個二硫鍵的4個半胱氨酸，使其不僅可靶向運輸，還耐高溫和酸性條件[7-9]。其生物學(xué)功能尚不明確，可能在真菌生長和發(fā)育的不同時期發(fā)揮作用，有研究表明，其與菌絲生長或孢子形成有關(guān)；其可在植物細(xì)胞壁或植物定殖中發(fā)揮作用；與毒性相關(guān)；可刺激植物免疫系統(tǒng)，誘發(fā)保護(hù)機(jī)制等等[10]?！颈狙芯壳腥朦c】本研究對MSP1的一般理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、磷酸位點等基本屬性進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pETSUMO-MSP1，對其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并通過鎳離子親和層析、陰離子交換層析以及分子篩層析等純化方法對其進(jìn)行純化?！緮M解決的關(guān)鍵問題】最終獲得大量高純蛋白，旨在為后續(xù)進(jìn)一步探索該蛋白的功能、互作蛋白分析、作用機(jī)理以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等研究提供一定的理論與實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究使用的MSP1的氨基酸序列，來自NCBI數(shù)據(jù)庫XP_003710181.1；大腸桿菌表達(dá)載體pETSUMO_1b，實驗室提供；大腸桿菌克隆菌株DH5(及表達(dá)菌株E.coliBL21(DE3)的感受態(tài)細(xì)胞，北京莊盟國際生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 MSP1的生物信息學(xué)分析 利用ExPASy-ProtParam和Prot Scale工具分別分析MSP1的一般理化性質(zhì)及親疏水性[11-13]；使用NCBI BLAST和NetPhos 3.1分別分析MSP1的保守結(jié)構(gòu)域和磷酸化位點[14-15]；在Pfam數(shù)據(jù)庫中分析該蛋白所在家族成員[16]；使用工具TMHmmol/L和ExPASy Prosite分別預(yù)測MSP1跨膜結(jié)構(gòu)域和結(jié)構(gòu)功能位點[17-19]；使用在線工具Phobius和Signal P預(yù)測MSP1的信

號肽位點[20]；使用在線工具SOPM和Phyre 2 預(yù)測MSP1的二級和三級結(jié)構(gòu)[21-23]。軟件詳細(xì)網(wǎng)址及對應(yīng)分析功能如表1所示。

表1 生物信息學(xué)分析軟件表

1.2.2 pETSUMO_1b-MSP1蛋白的構(gòu)建 根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫提供的MSP1(MGG-05344)基因序列去除信號肽序列后設(shè)計引物，克隆MSP1(MGG-05344)基因；使用雙酶切法和Sticky-End法對MSP1(MGG-05344)基因和表達(dá)載體pETSUMO_1b進(jìn)行切割和重新連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體pETSUMO_1b-MSP1，熱激轉(zhuǎn)化至大腸桿菌克隆菌株DH5α，通過PCR擴(kuò)增檢測將陽性質(zhì)粒測序，測序正確后用于后續(xù)試驗[1]。

1.2.3 pETSUMO_1b-MSP1蛋白表達(dá)與純化 將重組蛋白pETSUMO_1b-MSP1熱激轉(zhuǎn)化至菌株E.coliBL21(DE3)中。在含100 μg/mL Amp(氨芐青霉素)的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃、220 r·min-1振搖8 h，培養(yǎng)至OD600為0.5～0.6。分別以0.1和0.3 mmol/L IPTG作為誘導(dǎo)劑，在18 ℃、180 r·min-1誘導(dǎo)20 h或37 ℃、180 r·min-1誘導(dǎo)10 h后收集菌體[24-25]。加入緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑)超聲裂解菌體重懸液，將得到的蛋白粗提液經(jīng)15 000 r·min-1高速離心后，取上清液過Ni+親和柱，并加入20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，咪唑濃度梯度為40～200 mmol/L(40、80、100、200 mmol/L)的緩沖液洗脫結(jié)合蛋白，將含有大量蛋白的咪唑洗脫液使用截留分子量為10 KD的濃縮管進(jìn)行適當(dāng)濃縮[26-27]。將純化后的蛋白進(jìn)行脫鹽處理，脫鹽緩沖液為20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0。根據(jù)pETSUMO_1b-MSP1的理論等電點(5.3)，選用ResourceTMQ層析柱，A泵和B泵緩沖液分別為：20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1.0 M NaCl進(jìn)行離子交換層析，純化后濃縮洗脫液[28]。選用GE superdexTM200 10/300GL層析柱，使用緩沖液20 mmol/L Tris-Hcl，pH 8.0，150 mmol/L NaCl進(jìn)行分子篩層析[29]。將高含量洗脫液使用10 KD濃縮管濃縮至10 mg·mL-1,存放于-20 ℃?zhèn)溆?。上述操作結(jié)束后均使用SDS-PAGE檢測洗脫液中重組蛋白含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 MSP1的生物信息學(xué)結(jié)果分析

2.1.1 一般理化性質(zhì)分析 MSP1的一般理化性質(zhì)結(jié)果顯示，該蛋白的分子式為C617H955N173O201S6，總原子數(shù)為1952，分子量為14 204.77 Da(約14.2 KD)，理論等電點為4.6，平均親和性與不穩(wěn)定指數(shù)分別為0.032和41.32。因此，該蛋白為不穩(wěn)定性疏水蛋白，與在線軟件Prot Scale的預(yù)測結(jié)果(圖1)相似。

2.1.2 MSP1的保守結(jié)構(gòu)域及功能位點分析 MSP1的保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果如圖2所示，此蛋白存在Cerato-platanin結(jié)構(gòu)域，屬于Cerato-platanin家族成員。功能位點分析結(jié)果顯示該蛋白無功能位點。

2.1.3 MSP1的跨膜結(jié)構(gòu)域、信號肽及磷酸化位點分析 MSP1的跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽預(yù)測結(jié)果如圖3～4所示，此蛋白質(zhì)不含跨膜結(jié)構(gòu)域，在N端含一

段信號肽，為氨基酸序列1～18位，與Signal P預(yù)測結(jié)果一致。此結(jié)果表明，該蛋白不屬于膜蛋白，屬于非典型分泌蛋白，推測其具有運輸功能。磷酸化位點預(yù)測結(jié)果如圖5所示，該蛋白共存在11個磷酸化位點，分別是位于第25、48、54、80和85位的蘇氨酸(Thr)位點，位于第31、38、40、119和127位的絲氨酸(Ser)位點和第27位的酪氨酸(Tyr)位點。

2.1.4 MSP1的結(jié)構(gòu)分析 MSP1由137個共20種常見氨基酸組成。其二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)分別如圖6～7所示，其中，二級結(jié)構(gòu)包含α-螺旋(Hh)、延伸鏈(Ee)、β-轉(zhuǎn)角(Tt)和無規(guī)卷曲(Cc)，數(shù)量分別為33、42、14和48，各占比24.09%、30.66%、10.22%和35.04%。

2.2 pETSUMO-MSP1蛋白表達(dá)與純化結(jié)果分析

2.2.1 pETSUMO-MSP1的誘導(dǎo)表達(dá) 本研究在誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)的過程中為最大程度獲得重組蛋白，進(jìn)行了誘導(dǎo)溫度以及誘導(dǎo)劑濃度的篩選試驗。結(jié)果表明，當(dāng)誘導(dǎo)溫度為18或37 ℃時，均可誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，但18 ℃誘導(dǎo)20 h比37 ℃誘導(dǎo)10 h的誘導(dǎo)表達(dá)量要高。當(dāng)誘導(dǎo)劑IPTG的濃度為0.3 mmol/L時可誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，而濃度為0.1 mmol/L時誘導(dǎo)表達(dá)不明顯。因此，使用0.3 mmol/LIPTG作為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)條件為18 ℃ 20 h可較好的誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，即以此為后續(xù)純化試驗所用的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件。

2.2.2 鎳離子親和層析 親和層析電泳檢測結(jié)果如圖8所示，當(dāng)咪唑濃度為40、80、100和200 mmol/L時均可洗脫重組蛋白，但在咪唑濃度為80和100 mmol/L時洗脫的蛋白含量更高且無明顯差異，因此，親和層析緩沖液的最適咪唑濃度為80或100 mmol/L。由于親和層析后電泳圖中可見明顯雜帶，因此，需要進(jìn)一步純化。

2.2.3 陰離子交換層析 蛋白脫鹽處理和陰離子交換層析的結(jié)果如圖9所示，在脫鹽穿出液B液和C液中均可檢測到重組蛋白，B液中含量較高，因此使用B液進(jìn)行進(jìn)一步純化。純化結(jié)果顯示，該蛋白呈現(xiàn)雙洗脫峰，分散性較好，帶電性質(zhì)較均一，主峰在16.04 mS/cm且表現(xiàn)出對低鹽條件的耐受性。SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果顯示，洗脫液D液和F液均可檢測到大量重組蛋白，其中，D液較F液的蛋白含量高，且F液存在雜帶，表明可能存在雜蛋白，仍需進(jìn)一步純化分析。

2.2.4 分子篩層析 分子篩結(jié)果如圖10所示，該蛋白具單一洗脫峰，對稱性良好，最大峰出峰位置為17.1 mL，分子量約為20 KD，結(jié)合SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果，洗脫液C液和D液中均可檢測到大量重組蛋白，且均無雜帶，電泳條帶均出現(xiàn)在約20 KD，表明該蛋白極有可能以單體的形式存在，且已成功純化并得到該重組蛋白。

3 討 論

稻瘟病是最具迫害性的病害之一，可使禾本科作物減產(chǎn)，嚴(yán)重時可造成絕產(chǎn)[30-32]。多年來，對CPPs展開了大量的研究，雖然多數(shù)研究表明缺乏CPPs的菌株表型與野生型無顯著差異，但仍有研究表明CPPs在真菌整個生長和發(fā)育的不同階段發(fā)揮作用。如，核盤菌缺失CP1/Sm1引發(fā)菌核和菌絲生長異常、感染力降低等現(xiàn)象[33]；球孢白僵菌缺失CgCP1(炭疽病菌)雖然菌絲生長正常，但會使減少分生孢子數(shù)[34]；稻瘟病菌缺失MSP1會導(dǎo)致毒性降低[4]；核盤菌的CP1/Sm1可與PR1相互作用，通過抑制PR1的抗真菌活性提高真菌的毒性等[35]。本研究得到的MSP1的生物信息學(xué)分析結(jié)果與Jeong Jun Seop等人的研究結(jié)果相符，如分子量大小、親疏水性及蛋白家族等。在UNIPROT數(shù)據(jù)庫中查詢到該蛋白存在兩個互作蛋白MGG-06538(Bys1 family protein)和MGG-08622(Nucleoside diphosphate kinase)，但在KEGG數(shù)據(jù)庫中未查詢到該蛋白參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，表明該蛋白的作用機(jī)制還尚未明確，因此，表達(dá)純化MSP1對于后續(xù)研究該蛋白的具體功能以及作用機(jī)制具有重要意義。

本研究最終得到大量MSP1高純蛋白，可供后續(xù)分析該蛋白的功能使用。在后續(xù)研究中設(shè)計如下研究方案：①利用Pull down技術(shù)篩選和鑒定該蛋白的互作蛋白并分析互作關(guān)系；②使用酵母雙雜交和等溫滴定量熱法分析互作蛋白功能；③設(shè)計該蛋白的晶體生長試驗，進(jìn)一步探索該蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。關(guān)于MSP1我們已經(jīng)掌握的信息還很少，暫時無法解釋其所具有的功能以及如何影響毒力，因此，還需要大量的試驗去探索該蛋白的功能、作用機(jī)理等一系列問題。

4 結(jié) 論

本研究通過對MSP1進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測到該蛋白的分子量約為14.2 KD，由137個氨基酸組成，等電點為4.6，屬于Cerato-platanin家族成員。該蛋白N端1～19位氨基酸構(gòu)成信號肽序列，無跨膜結(jié)構(gòu)，屬于非典型分泌蛋白，存在11個磷酸化活性位點，分別是5個蘇氨酸位點、5個絲氨酸位點和1個酪氨酸位點。二級結(jié)構(gòu)由延伸鏈、α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲構(gòu)成。誘導(dǎo)該蛋白表達(dá)的最適條件為0.3 mmol/L IPTG，18 ℃，180 r·min-1，20 h。鎳離子親和層析的最適緩沖液為20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，80 mmol/L、100 mmol/L咪唑。陰離子交換層析表明該蛋白耐低鹽條件。分子篩層析具單一峰，出峰位置為17.1 mL，分子量約20 KD，緩沖液為20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，150 mmol/L NaCl，推測該蛋白以單體形式存在。本研究最終成功純化大量重組蛋白，可為進(jìn)一步探索MSP1的晶體結(jié)構(gòu)、功能以及分析互作蛋白完善相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路奠定一定的理論與實踐基礎(chǔ)。