韋麗君，俞奔馳，宋恩亮，檀小輝，鄭 華，周時藝，文 峰，盧賽清，付海天

(廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530001)

【研究意義】木薯可用于生產(chǎn)變性淀粉、淀粉糖和乙醇等涉及國計民生各領(lǐng)域的3000多種產(chǎn)品[1]。我國木薯原料生產(chǎn)嚴重不足，木薯貿(mào)易以進口鮮木薯、木薯淀粉和木薯干為主，年進口數(shù)量約1045.90萬t，進口金額約22.20億美元，是世界上最大的木薯進口國[2]。隨著木薯品種退化和病蟲害日益嚴重，我國木薯原料生產(chǎn)又遭遇了新的挑戰(zhàn)，選育出適應(yīng)市場需求的新品種已成為促進我國木薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展壯大的重大課題。雜交育種是獲得木薯新品種的主要途徑，但我國大部分地區(qū)的木薯在自然條件下不開花，難以開展木薯雜交育種工作。已有研究報道木薯生長發(fā)育受到內(nèi)源激素影響和外施氨基酸能誘導(dǎo)木薯開花和早開花[3-4]，但目前對木薯花芽分化過程中內(nèi)源激素和氨基酸生理變化的了解甚少。因此，分析木薯花芽分化植株與花芽未分化植株內(nèi)源激素和氨基酸含量的差異，對木薯成花機理研究及花期調(diào)控具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】花芽分化是植物進入生殖生長的標志，葉芽在轉(zhuǎn)變?yōu)榛ㄑ窟^程中其形態(tài)會發(fā)生改變，生理生化方面也發(fā)生復(fù)雜變化。從營養(yǎng)生長到生殖生長的過渡是被子植物生長過程中的主要變化階段，激素在這一過程中發(fā)揮著重要作用[5]。段九菊等[6]研究表明，高玉米素核苷(ZRs)含量和高脫落酸(ABA)/赤霉素(GAs)、ZRs/GAs、ZRs/IAA及低GAs含量有利于鳳梨丹尼斯完成花芽分化。蔡坤秀等[7]研究發(fā)現(xiàn)，葉底紅葉片內(nèi)源激素中生長素(IAA)、赤霉素3(GA3)、玉米素核苷(ZR)和ABA與花芽分化密切相關(guān)，高水平的ABA/IAA、ZR/IAA和ZR/GA3有利于花芽分化。氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，也是植物體內(nèi)重要的生物活性物質(zhì)[8]，其合成與代謝是植物體內(nèi)重要的生理生化過程。劉孝仲等[9]研究報道，僅依靠不同激素間的平衡不能誘導(dǎo)花原基形成，花原基形成需要大量氨基酸參與。孫文全和褚孟源[10]研究顯示，花芽生理分化可能同樣需要大量氨基酸。Jackson和Sweet[11]研究指出，提高植物體內(nèi)氨基酸含量有利于花芽形成。馬青枝和李秉真[12]研究認為，在蘋果梨生理分化期加強肥水管理，可為氨基酸積累提供物質(zhì)基礎(chǔ)，有利于花芽分化。可見，內(nèi)源激素水平和氨基酸狀況對植物花芽分化具有重要影響?！颈狙芯壳腥朦c】花芽分化期是木薯成花轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵時期，但目前關(guān)于內(nèi)源激素及氨基酸對木薯花芽分化響應(yīng)的研究未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以木薯品種新選048花芽分化始期的植株與未進入花芽分化的植株為樣本，采集兩種植株的莖、葉和芽進行內(nèi)源激素和氨基酸靶向代謝物檢測，對比分析其差異性，為木薯成花的生理機理研究及花期調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為木薯品種新選048(ManihotesculentaCrantz cv. Xinxuan No.048)花芽分化始期的植株和花芽未分化的健康植株，取其芽(即花芽和葉芽)、葉(靠近頂芽的第5片完全展開葉)和莖(靠近頂芽第5～7片完全展開葉間的莖段)各約5 g，3次重復(fù)，快速用液氮速凍后置于帶干冰的泡沫箱內(nèi)，帶回室內(nèi)存放于-80 ℃超低溫冰箱中備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 內(nèi)源激素含量測定 樣品提?。簭?80 ℃冰箱中取莖、葉和芽樣品各約100.0 mg，分別加入氧化鋯珠、1.5 mL提取液(甲醇∶水∶甲酸=7.9∶2.0∶0.1，再加入少量抗氧化劑二乙基二硫代氨基甲酸鈉)；破碎機破碎2 min后用超聲儀超聲約30 min(注意破碎機管支架提前預(yù)冷，超聲儀中加入冰袋)；4 ℃浸提過夜，取上清備用。

樣品純化：依次用4.0 mL甲醇、2.0 mL 0.1 mol/L氨水溶液活化小柱，樣品經(jīng)真空濃縮后加入0.1 mol/L氨水溶液定容至2.0 mL，過MAX小柱；依次用2.0 mL 0.1 mol/L氨水溶液、2.0 mL 0.1 mol/L氨水60%甲醇溶液淋洗后，加入2.5 mL 1.25 mol/L FA、70%甲醇溶液和1.0 mL甲醇溶解，稀釋5倍上機。

測定指標及方法：采用液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)測定生長素(IAA)、脫落酸(、油菜素內(nèi)酯(BR)、赤霉素1(GA1)、GA3、赤霉素4(GA4)、赤霉素7(GA7)、玉米素核苷、反式玉米素核苷(TZR)、水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)、茉莉酸甲酯(JA-Me)、茉莉酸亮氨酸(JA-Leu)、腺嘌呤(Adenine)和腺苷(Adenosine)等15種內(nèi)源激素含量。色譜條件：采用Waters超高效液相系統(tǒng)，采用Waters HSS T3(50×2.1 mm，1.8 μm)液相色譜柱，進樣量為2.0 μL，流動相A為0.1%甲酸-水溶液，流動相B為0.1%甲酸-乙腈。質(zhì)譜條件：采用美國Thermo公司的Q exactive高分辨質(zhì)譜檢測系統(tǒng)，優(yōu)化的質(zhì)譜分析條件為鞘氣40、輔助氣10、離子噴霧電壓-2800 V、溫度350 ℃、離子傳輸管溫度320 ℃。

1.2.2 氨基酸含量測定 樣品提?。簭?80 ℃冰箱中取出莖、葉和芽樣品，在液氮下研磨；然后精密稱量100.0 mg，用500.0 μL 0.1 mol/L鹽酸渦旋溶解，37 ℃搖床孵育1 h，12 000 r/min離心10 min，取上清備用。樣品衍生化：取10.0 μL樣品注入清潔的樣品衍生管底部，加70 μL緩沖液渦旋混勻，移取20 μL衍生試劑溶液邊渦旋邊加入樣品管中，衍生后用封口膜封口，55 ℃加熱10 min，冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移至干凈樣品瓶中。

測定指標及方法：采用超高效液相色譜法測定D-α-氨基正丁酸(RABA)、γ-氨基丁酸(GABA)、半胱氨酸(CysH)、胱氨酸(Cys)、苯丙氨酸(Phe)、丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、甲硫氨酸(Met)、精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)、酪氨酸(Tyr)、亮氨酸(Leu)、脯氨酸(Pro)、色氨酸(Trp)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、纈氨酸(Val)、異亮氨酸(ILE)和組氨酸(His)等23種氨基酸含量。色譜條件：色譜柱為ACCQ-TAG TMULTRA C18 1.7 μm 2.1 ×100 mm，流速0.7 μL/min，柱溫50 ℃，流動相A為AccQ·TagtmUltra Eluent A Concentrate，流動相B為AccQ·TagtmUltra Eluent B，依次按0 min、B 0%，0.29 min、B 0.5%，5.49 min、B 9.1%，7.49 min、B 21.2%，7.79 min、B 59.6%，8.39 min、B 59.6%，8.48 min、B 0%，9.25 min、B 0%和13.0 min、B 0%進行梯度洗脫后，在波長為260 nm的UV-VIS檢測器下進行檢測。

1.3 統(tǒng)計分析

采用Excel 2003和SPSS 19.0對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和差異性分析，采用R4.0.5進行Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 木薯花芽分化株與花芽未分化株內(nèi)源激素含量的差異

2.1.1 莖內(nèi)源激素含量的差異 由表1可知，花芽分化株木薯莖的GA4、GA7、ZR、TZR、SA、Adenine和Adenosine含量極顯著高于花芽未分化株(P<0.01，下同)，GA1、JA和JA-Leu含量極顯著低于花芽未分化株，IAA和BR含量顯著低于花芽未分化株(P<0.05，下同)，而ABA、GA3和JA-Me含量間差異不顯著(P>0.05，下同)。其中，花芽分化株莖的Adenosine含量與花芽未分化株差異最明顯，達285.00倍，其次依次為Adenine、ZR、JA、GA4和SA含量，與花芽未分化株差異依次達90.33、48.80、5.80、4.10和3.59倍。可見，木薯從營養(yǎng)生長到花芽分化，莖部的大部分種類內(nèi)源激素(12/15)含量發(fā)生了顯著或極顯著變化。

2.1.2 葉片內(nèi)源激素含量的差異 由表1可知，花芽分化株木薯葉的IAA和ABA含量極顯著低于花芽未分化株，TZR、JA和JA-Leu含量極顯著高于花芽未分化株，SA含量顯著高于花芽未分化株，而BR、GA1、GA3、GA4、GA7、ZR、JA-Me、Adenine和Adenosine含量間差異不顯著。其中，花芽分化株葉的TZR含量與花芽未分化株差異最明顯，為12.09倍，其次分別為JA-Leu和JA含量，與花芽末分化株的差異分別達6.38和5.85倍。可見，木薯從營養(yǎng)生長到花芽分化，葉片只有少部分種類內(nèi)源激素(6/15)含量發(fā)生了顯著或極顯著改變。

2.1.3 芽內(nèi)源激素含量的差異 由表1可知，花芽分化株芽的GA3和JA含量顯著高于花芽未分化株，ZR、SA、JA-Me和JA-Leu含量極顯著高于花芽未分化株，其余芽的內(nèi)源激素含量與花芽未分化株差異不顯著。其中，花芽分化株芽的ZR含量與花芽未分化株差異最明顯，達19.58倍，其次為JA-Me和JA-Leu含量，分別是花芽未分化株的6.17和6.15倍?？梢姡臼韽臓I養(yǎng)生長到花芽分化，芽部只有少部分內(nèi)源激素(6/15)含量發(fā)生了顯著或極顯著變化。

表1 花芽分化株與花芽未分化株木薯的內(nèi)源激素含量對比

綜上所述，花芽分化株和花芽未分化株木薯地上部內(nèi)源激素含量的差異主要發(fā)生在莖部，說明莖內(nèi)源激素含量的改變對木薯花芽分化發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用，其中，GA4、GA7、ZR、TZR、SA、Adenine和Adenosine的累積對木薯花芽分化具有促進作用，IAA、BR和GA1的累積則抑制木薯花芽分化。

2.2 木薯花芽分化株與花芽未分化株氨基酸含量的差異

2.2.1 莖氨基酸含量的差異 由表2可知，花芽分化株木薯莖的RABA、GABA、CysH、Phe、Gly、Glu、Gln、Met、Lys、Tyr、Leu、Pro、Trp、Ser、Thr、Asp、Asn、Val、ILE和His共20種氨基酸含量均極顯著高于花芽未分化株，僅Cys含量極顯著低于花芽未分化株，而Ala含量間差異不顯著；花芽分化株莖的Arg含量達1717.02 mg/kg，而在花芽未分化株中未檢出；花芽分化株的His、Met、Gln、Asn、Thr、CysH、Tyr、Val和ILE含量與花芽未分化株差異較明顯，均在6倍以上?？梢姡臼韽臓I養(yǎng)生長到花芽分化，莖部大部分種類氨基酸(21/23)含量顯著或極顯著增加，表明莖是木薯花芽分化時氨基酸的儲藏器官。

2.2.2 葉片氨基酸含量的差異 由表2可知，花芽分化株木薯葉片的Cys和Gln含量極顯著高于花芽未分化株，花芽分化株的GABA、CysH、Glu、Lys、Leu、Pro、Asp、His、Phe含量顯著或極顯著低于花芽未分化株，而RABA、Gly、Met、Trp、Ser、Thr、Asn、Val和ILE含量間差異不顯著；花芽分化株和花芽未分化株葉片均未檢出Arg和Thy；花芽分化株與花芽未分化株葉氨基酸含量差異最明顯的為CysH，達3.73倍，其次為Gln、Leu和Pro，依次達3.40、2.40和2.34倍。可見，木薯從營養(yǎng)生長到花芽分化，葉部氨基酸含量中有部分(11/23)發(fā)生了顯著或極顯著變化，其中以含量降低居多。

2.2.3 芽氨基酸含量的差異 由表2可知，花芽分化株木薯芽的CysH、Gly和Asn含量顯著或極顯著高于花芽未分化株，GABA、Phe、Arg和Trp含量極顯著低于花芽未分化株，RABA、Cys、Ala、Glu、Gln、Met、Lys、Leu、Pro、Ser、Thr、Asp、Val、ILE和His含量差異不顯著，而Tyr未檢出；兩種植株木薯芽氨基酸含量差異較明顯的是Arg和GABA，分別為2.02和1.72倍?？梢?，木薯從營養(yǎng)生長到花芽分化，芽部只有少部分種類氨基酸(7/23)含量發(fā)現(xiàn)顯著或極顯著變化。

表2 花芽分化株與花芽未分化株木薯的氨基酸含量對比

綜上所述，花芽分化株和花芽未分化株木薯地上部氨基酸含量的差異主要發(fā)生在莖部，說明莖部氨基酸含量的改變對木薯的花芽分化發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其中，RABA、Gly、Gln、Met、Tyr、Ser、Thr、Asn、Val和ILE的累積能促進木薯花芽分化。

2.3 木薯地上部內(nèi)源激素含量與氨基酸含量的相關(guān)分析

由表3可知，IAA含量與GABA、Cys、Ala、Glu和Lys含量呈極顯著正相關(guān)，與Phe、Gly、Gln、Met、Arg、Tyr、Trp、Ser、Thr、Val、ILE和His含量呈顯著或極顯著負相關(guān)；ABA含量與CysH、Pro和Asn含量呈極顯著正相關(guān)，與Met、Arg、Tyr、ILE和His含量呈顯著或極顯著負相關(guān)；BR含量與RABA、Phe、Gly、Gln、Met、Arg、Tyr、Trp、Ser、Thr、Val、ILE和His含量呈顯著或極顯著負相關(guān)；GA1含量與CysH、Pro、Asn含量呈極顯著正相關(guān)，與GABA、Cys、Glu、Arg、Lys、Tyr和Leu含量呈顯著或極顯著負相關(guān)；GA3含量與Phe、Gln、Met、Arg、Tyr、Trp、Thr、Val、ILE和His含量呈顯著或極顯著正相關(guān)，與Cys、Ala、Glu、Pro和Asp含量呈顯著或極顯著負相關(guān)；GA4含量與RABA、GABA、Phe、Gln、Met、Arg、Lys、Tyr、Leu、Trp、Thr、Val、ILE和His含量呈顯著或極顯著正相關(guān)，與Asn含量呈極顯著負相關(guān)；GA7含量與RABA、GABA、Gln、Met、Arg、Lys、Tyr、Leu、Thr、Val、ILE和His含量呈顯著或極顯著正相關(guān)，與CysH、Pro和Asp含量呈顯著或極顯著負相關(guān)；ZR含量與RABA、CysH、Phe、Gly、Gln、Tyr、Pro、Trp、Ser、Thr、Asp、Asn、Val、ILE和His含量呈顯著或極顯著正相關(guān)，與Cys含量呈顯著負相關(guān)；TZR含量與RABA、Phe、Gly、Gln、Met、Arg、Tyr、Leu、Trp、Ser、Thr、Asp、Val、ILE和His含量呈顯著或極顯著正相關(guān)，與Gly含量呈顯著負相關(guān)；SA含量與CysH、Gly、Pro、Ser、Thr、Asp和Asn含量呈極顯著正相關(guān)，與Cys含量呈極顯著負相關(guān)；JA含量與Cys含量呈極顯著正相關(guān)，與CysH、Phe、Gly、Tyr、Pro、Trp、Ser、Asp和Asn含量呈顯著或極顯著負相關(guān)；JA-Me含量與CysH、Pro和Asn含量呈極顯著正相關(guān)；JA-Leu含量與Cys和Asn含量呈極顯著正相關(guān)，與GABA和Leu含量呈顯著負相關(guān)；Adenine和Adenosine含量與RABA、Phe、Gly、Gln、Met、Arg、Tyr、Leu、Trp、Ser、Thr、Asp、Val、ILE和His含量呈極顯著正相關(guān)；Adenine含量與Cys含量呈顯著負相關(guān)?？梢?，GA3、GA4、GA7、ZR、TZR、Adenine和Adenosine含量均與Gln、Met、Tyr、Thr、Val、ILE和His含量呈正相關(guān)關(guān)系，IAA、ABA、BR、GA1、JA、JA-Me和JA-Leu含量與Gln、Met、Tyr、Thr、Val、ILE和His含量均呈負相關(guān)關(guān)系，總體上與2.1和2.2的木薯植株地上部內(nèi)源激素GA3、GA4、GA7、ZR、TZR、SA、JA-Me、Adenine和Adenosine及氨基酸RABA、Gln、Met、Tyr、Thr、Val、ILE、Gly、Ser和Asn的累積，以及內(nèi)源激素IAA、BR和GA1的降解能促進木薯花芽分化的研究結(jié)果吻合。

表3 木薯內(nèi)源激素含量與氨基酸含量的相關(guān)系數(shù)

3 討 論

營養(yǎng)是花芽分化及花器官形成與生長的物質(zhì)基礎(chǔ)[21]，營養(yǎng)物質(zhì)的主要來源是蛋白質(zhì)，合成蛋白質(zhì)的前體物質(zhì)是氨基酸。因此，氨基酸在作物成花中的動態(tài)變化逐漸引起了越來越多的關(guān)注。馬青枝和李秉真[12]研究報道，蘋果梨花芽形態(tài)分化前均積累了一定量的氨基酸，其中的Glu含量一直處于最高水平。李利紅和連艷鮮[22]研究發(fā)現(xiàn)，Tyinthos和金杏兩種杏的花芽萌發(fā)過程中氨基酸含量呈現(xiàn)上升趨勢。劉俊松和張上隆[23]研究表明，柑橘結(jié)果樹的17種氨基酸含量及其總量均高于未結(jié)果樹，說明柑橘花芽分化有賴于一定總量的氨基酸合成和積累。沈方科等[21]研究表明，四季蜜芒的游離氨基酸含量為其花芽分化提供了充足氮源。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，木薯莖部氨基酸的累積對其花芽分化發(fā)揮著促進作用，表現(xiàn)在木薯從營養(yǎng)生長進入花芽分化階段莖部絕大部分種類的氨基酸(21/23)含量極顯著累積，而葉和芽部大部分種類的氨基酸含量變化不明顯，說明莖部是木薯花芽分化時氨基酸的主要儲藏器官，并能在需要時快速啟動莖韌皮部的長距離運輸通道，將氨基酸快速運達所需部位。其中，木薯從營養(yǎng)生長過渡到花芽分化的生殖生長，其莖的RABA、Gly、Gln、Met、Tyr、Ser、Thr、Asn、Val和ILE含量顯著或極顯著升高，尤其是Gln、Met、Thr和Asn含量升高達6倍以上，可考慮用作木薯花芽分化的氨基酸指示指標。

花芽分化受到多種因素的調(diào)節(jié)與控制。阿布都卡尤木·阿依麥提等[24]研究表明，營養(yǎng)物質(zhì)和內(nèi)源激素間相輔相成、相互促進又相互拮抗，其動態(tài)變化和平衡對棗的花芽分化發(fā)揮至關(guān)重要作用。本研究結(jié)果表明，木薯內(nèi)源激素IAA、BR、GA1、GA3、GA4、GA7、ZR、TZR、Adenine和Adenosine含量與部分氨基酸(10種或10種以上)含量關(guān)系密切，其消長共同調(diào)控木薯的花芽分化進程，其中，IAA和BR含量與Gln、Met、Tyr、Thr、Val、ILE和His含量呈顯著或極顯著負相關(guān)，GA3、GA4、GA7、ZR、TZR、Adenine和Adenosine含量與Gln、Met、Tyr、Thr、Val、ILE和His含量呈顯著或極顯著正相關(guān)(除ZR含量與Met含量外)。結(jié)合內(nèi)源激素和氨基酸對木薯花芽分化的響應(yīng)程度及二者間的相關(guān)程度，本研究認為內(nèi)源激素GA4、Adenosine和Adenine含量及氨基酸Gln、Met、Thr、Tyr、Val和ILE含量的大幅度升高是指示木薯從營養(yǎng)生長過渡到花芽分化生長的理想生理指標。木薯花芽分化是營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的轉(zhuǎn)折點，其過程的一系列生理狀態(tài)轉(zhuǎn)變不僅取決于內(nèi)源激素含量的變化，也取決于氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)含量的變化，其消長共同控制木薯組織中的營養(yǎng)轉(zhuǎn)向，從而對植株芽的分化發(fā)揮調(diào)控作用。

4 結(jié) 論

木薯從營養(yǎng)生長過渡到花芽分化的生殖生長，莖部的內(nèi)源激素及氨基酸反應(yīng)最活躍，其中，GA4、GA7、ZR、TZR、SA、Adenine、Adenosine、RABA、Gly、Gln、Met、Tyr、Ser、Thr、Asn、Val和ILE的累積，以及IAA、BR和GA1的降解，對其花芽分化發(fā)揮促進作用；GA4、Adenosine、Adenine、Gln、Met、Thr、Tyr、Val和ILE含量大幅度升高可作為指示木薯花芽分化起始的最佳生理指標。