熊玉超，曾旭文，梁治平，黃樂(lè)平，賈嫵懿

下腰痛(low back pain，LBP)是指后背腰骶部疼痛或不適。在我國(guó)下腰痛患者的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。成人下腰痛的主要原因是腰椎間盤(pán)退變(intervertebral disc degeneration，IVDD)[1]。目前臨床上針對(duì)椎間盤(pán)源性下腰痛的治療方法不能從根本上治療椎間盤(pán)退變，而在退變?cè)缙谇‘?dāng)干預(yù)可避免患者病情逐漸加重，早期發(fā)現(xiàn)已經(jīng)成為其診治的關(guān)鍵。臨床上常采用Pfirrmann等[2]提出的椎間盤(pán)退變形態(tài)學(xué)分級(jí)方法，這種分級(jí)方法屬于一種半定量視覺(jué)分級(jí)系統(tǒng)，但仍是一種主觀(guān)評(píng)價(jià)方法。T2-mapping及T2*-mapping能夠反映組織的內(nèi)在特性，能夠提供組織內(nèi)水含量、膠原纖維排列方式及含量和其它基質(zhì)結(jié)構(gòu)等方面的信息[3]。已有較多研究肯定了T2-mapping及T2*-mapping技術(shù)在分析軟骨組織、椎間盤(pán)和其它關(guān)節(jié)的生物化學(xué)和結(jié)構(gòu)改變方面的能力[4-9]。但迄今為止，尚沒(méi)有研究同時(shí)將IVDD的T2-mapping和T2*-mapping與組織學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。本研究通過(guò)建立糖尿病兔的椎間盤(pán)退變模型，分析不同組織學(xué)退變?cè)u(píng)分的髓核T2和T2*弛豫時(shí)間的差異，探T2-mapping及T2*-mapping技術(shù)對(duì)腰椎間盤(pán)退變的診斷價(jià)值并分析其與髓核生物化學(xué)特征的相關(guān)性，旨在為椎間盤(pán)退變的早期診斷提供參考。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)分組及模型的建立

實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為正常對(duì)照組(15只)和糖尿病模型組(15只)。糖尿病模型組和對(duì)照組分別按MR掃描時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)均分為3組：1、3和6月組。每只實(shí)驗(yàn)兔在MRI掃描后進(jìn)行解剖，取L6-7、L7-S1椎間盤(pán)進(jìn)行病理切片。

模型組在造模前均禁食16 h，稱(chēng)重。在常溫狀態(tài)下配置5%的四氧嘧啶溶液，經(jīng)兔耳緣靜脈一次性快速注射，劑量100 mg/kg；72 h后經(jīng)兔耳緣靜脈取血，使用快速血糖儀(強(qiáng)生)測(cè)量血糖濃度，若隨機(jī)血糖>16.7 mmol/L視為造模成功。造模成功后，每周測(cè)量試驗(yàn)兔的隨機(jī)血糖來(lái)檢測(cè)模型的穩(wěn)定性。

2.MRI方法和參數(shù)測(cè)量

為減少椎間盤(pán)晝夜變化的潛在影響，MRI檢查均在晚上進(jìn)行。使用Siemens Avanto 1.5T MR掃描儀及8通道膝關(guān)節(jié)線(xiàn)圈。待兔麻醉后，俯臥固定四肢，頭先進(jìn)，定位于兩側(cè)髂前上嵴連線(xiàn)中心。掃描序列包括矢狀面T2WI、T2-頻率選擇飽和法抑脂技術(shù)(spectral presaturation attenuated inversion recovery,SPAIR)、T2-mapping和T2*-mapping。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)后，設(shè)定掃描序列及參數(shù)如下。T2WI：TR 3500 ms，TE 82 ms，層厚3 mm，層間距0 mm，視野25 cm×25 cm，矩陣320×240，激勵(lì)次數(shù)2；T2-SPAIR：TR 3500 ms，TE 88 ms，層厚3 mm，層間距0 mm，視野32 cm×32 cm，矩陣320×240，激勵(lì)次數(shù)1；T2-mapping：TE分別為26、52、78、104、130、156、182和208 ms，TR 2200 ms，層厚2 mm，層間距0 mm，矩陣256×256，視野12 cm×12 cm，激勵(lì)次數(shù)1；T2*-mapping：TE分別為4.06、13.03、21.29、29.55和37.81 ms，TR 468 ms，層厚2.5 mm，層間距0 mm，矩陣256×256，視野12 cm×12 cm，激勵(lì)次數(shù)1。

掃描后將DICOM格式的各序列圖像導(dǎo)入MIPAV后處理軟件。首先在T2及T2*圖像上選取椎間盤(pán)顯示最佳的圖像，利用MIPAV軟件的Draw levelset ROI功能追蹤呈相對(duì)高信號(hào)區(qū)的椎間盤(pán)，再利用Smooth ROI功能對(duì)選擇區(qū)域進(jìn)行處理，使選擇的ROI變成類(lèi)橢圓形，ROI的面積為椎間盤(pán)面積的1/4，保證ROI位于椎間盤(pán)的髓核組織中。最后利用calculate statistics on ROI和Exclude pixels from cal-culate功能去除圖像噪聲并獲得ROI的平均T2值及平均T2*值(圖1)。

圖1 ROI選取示意圖。a)腰椎間盤(pán)T2*-mapping圖；b)選取L6-7椎間盤(pán)，利用 MIPAV軟件的Draw levelset ROI功能追蹤相對(duì)高信號(hào)區(qū)，勾畫(huà)出不規(guī)則形的ROI；c)利用Smooth ROI功能對(duì)所勾畫(huà)的ROI進(jìn)行處理，使ROI變成類(lèi)橢圓形。

3.病理檢查方法

HE染色：由一位研究生和一位病理科醫(yī)師按照Masuda等[10]提出的髓核組織學(xué)退變分級(jí)量表(表1)，對(duì)HE染色的椎間盤(pán)切片進(jìn)行髓核組織學(xué)退變?cè)u(píng)分，如兩者的意見(jiàn)不一致，則由另外一位病理科醫(yī)師參與評(píng)估。髓核組織學(xué)退變?cè)u(píng)分為髓核細(xì)胞與髓核基質(zhì)的評(píng)分相加，評(píng)分范圍為2～6分，2分為正常椎間盤(pán)， 3、4分為早期椎間盤(pán)退變，5、6分為晚期椎間盤(pán)退變。

表1 髓核組織學(xué)退變?cè)u(píng)分量表

番紅O-固綠染色：番紅O是一種結(jié)合多陰離子的陽(yáng)離子染料，與多糖中陰離子基團(tuán)結(jié)合。番紅O著色與陰離子的濃度近似成正比關(guān)系，間接反映了基質(zhì)中蛋白多糖的含量和分布。當(dāng)椎間盤(pán)退變時(shí)，髓核基質(zhì)中的蛋白多糖丟失，從而導(dǎo)致番紅O淡染或者不著色。

4.統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用單因素方差分析比較不同組織學(xué)評(píng)分之間髓核T2和T2*值的差異，多組數(shù)據(jù)間的兩兩比較采用Tukey法(方差齊性)或者Tamhane's法(方差不齊)；采用Spearman相關(guān)分析評(píng)估T2值、T2*值與髓核組織學(xué)退變?cè)u(píng)分的相關(guān)性。|r|>0.7為相關(guān)性強(qiáng)，|r|=0.5～0.7為相關(guān)性中等，|r|<0.5為相關(guān)性弱。

結(jié) 果

1.HE和番紅O-固綠染色

HE染色反映細(xì)胞形態(tài)的變化，而番紅O-固綠染色主要反映細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)蛋白聚糖的含量及分布情況。本組研究結(jié)果顯示，隨著退變的進(jìn)展，髓核細(xì)胞減少和髓核細(xì)胞空泡減小，髓核基質(zhì)凝結(jié)，髓核基質(zhì)染色程度逐漸降低(圖2)。

圖2 HE和番紅O-固綠染色圖像。a) 髓核組織學(xué)退變?cè)u(píng)分為2分的HE染色切片，髓核細(xì)胞呈多角性，在基質(zhì)凝膠狀結(jié)構(gòu)中有大的空泡,髓核基質(zhì)呈正常凝膠狀結(jié)構(gòu)，未見(jiàn)分層和裂隙；b) 髓核組織學(xué)退變?cè)u(píng)分為4分的HE染色切片髓核細(xì)胞數(shù)量輕度減少，空泡輕度減少,髓核細(xì)胞外基質(zhì)輕度皺縮；c) 髓核組織學(xué)退變?cè)u(píng)分為6分的HE染色切片,髓核細(xì)胞數(shù)量重度減少,髓核細(xì)胞周?chē)匆?jiàn)空泡,髓核細(xì)胞外基質(zhì)重度皺縮; d～f) 分別代表髓核組織學(xué)退變?cè)u(píng)分為2、4、6分的番紅O-固綠染色圖像；d) 髓核基質(zhì)染色深且清晰；e) 髓核基質(zhì)染色程度降低僅個(gè)別區(qū)域染色較深；f) 髓核基質(zhì)染色程度明顯降低。

2.組織學(xué)退變?cè)u(píng)分

模型組和對(duì)照組共計(jì)30只兔子60個(gè)椎間盤(pán)，兩組之間髓核組織學(xué)評(píng)分的比較結(jié)果見(jiàn)表2。髓核組織學(xué)退變?cè)u(píng)分為2分的椎間盤(pán)共14個(gè)，3分共22個(gè)，4分共10個(gè)，5分共6個(gè)，6分共8個(gè)。模型組與對(duì)照組之間髓核組織學(xué)退變?cè)u(píng)分的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=16.81，P=0.001)。

表2 對(duì)照組與模型組髓核組織學(xué)評(píng)分的比較 /個(gè)

3.不同組織學(xué)退變?cè)u(píng)分髓核T2值比較

組織學(xué)退變?cè)u(píng)分為2～6的髓核T2和T2*值測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表3。隨著組織學(xué)退變?cè)u(píng)分的增加，髓核T2和T2*值逐漸減小(圖3～4)。

圖3 L6-7和L7-S1椎間盤(pán)T2-mapping偽彩圖與解剖結(jié)構(gòu)圖像的融合圖，a～e圖上髓核組織學(xué)退變?cè)u(píng)分分別為2～6分(L6-7和L7-S1椎間盤(pán)內(nèi)髓核的組織學(xué)退變?cè)u(píng)分一致)。 圖4 L6-7和L7-S1椎間盤(pán)T2*-mapping偽彩圖與解剖結(jié)構(gòu)圖像的融合圖，a～e圖上髓核組織學(xué)退變?cè)u(píng)分分別為2～6分(L6-7和L7-S1椎間盤(pán)內(nèi)髓核的組織學(xué)退變?cè)u(píng)分一致)。

表3 不同組織學(xué)退變?cè)u(píng)分的髓核T2和T2*值

單因素方差分析結(jié)果顯示，不同組織學(xué)退變?cè)u(píng)分之間髓核T2值的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=101.16，P<0.01)。進(jìn)一步組間兩兩比較，2分組與4、5、6分組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； 3分組與4、5、6分組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；4分組與5、6分組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而2分組與3分組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；5分組與6分組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。髓核組織學(xué)退變?cè)u(píng)分與T2值呈高度負(fù)相關(guān)(r=-0.794，P<0.01)。

4.不同組織學(xué)退變?cè)u(píng)分髓核T2*值比較

不同組織學(xué)退變?cè)u(píng)分組之間髓核T2*值的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=24.13，P<0.01)。進(jìn)一步組間兩兩比較結(jié)果見(jiàn)圖6。其中，2分組與5、6分組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；3分組與5、6分組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；4分組與5、6分組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；5分組與6分組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而2、3、4分組之間兩兩比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。髓核組織學(xué)退變?cè)u(píng)分與T2*值呈中度負(fù)相關(guān)(r=-0.615，P<0.01)。

討 論

T2-mapping和T2*-mapping作為軟骨磁共振成像的新技術(shù)，最早用于評(píng)價(jià)四肢關(guān)節(jié)軟骨退變的生物化學(xué)改變，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外已成功應(yīng)用T2-mapping和T2*-mapping技術(shù)對(duì)關(guān)節(jié)軟骨病變進(jìn)行早期診斷[8,11]。椎間盤(pán)組織的生物化學(xué)成分與關(guān)節(jié)軟骨相似。T2-mapping和T2*-mapping用于定量評(píng)估腰椎間盤(pán)退變的效果已在既往的研究中得到了證實(shí)[12-14]，但大部分研究?jī)H僅將T2-mapping和T2*-mapping與Pfirrmann分級(jí)或者Thompson分級(jí)進(jìn)行對(duì)比，并未獲得組織病理學(xué)的證實(shí)。

本研究結(jié)果顯示，髓核組織學(xué)退變?cè)u(píng)分與T2值呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)關(guān)系，即使在髓核組織學(xué)評(píng)分為3和4分時(shí)，兩組間T2值的差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這與Chai等[15]和Gullbrand等[16]的研究結(jié)果一致，提示髓核的T2值具有識(shí)別早期椎間盤(pán)退變的能力。本研究結(jié)果還顯示隨著髓核組織學(xué)退變?cè)u(píng)分的升高，蛋白多糖(proteoglycan，PG)的染色程度也逐漸降低，這是由于在椎間盤(pán)退變的過(guò)程中，最早和最主要的變化是糖胺聚糖(Glycosaminoglycan，GAG)減少。GAG是PG的主要成分，主要影響椎間盤(pán)的高含水量和膨脹壓力，GAG的減少將會(huì)引起椎間盤(pán)細(xì)胞外基質(zhì)含水量降低，進(jìn)而導(dǎo)致T2值降低。Gullbrand等[16]使用離體木瓜蛋白酶消化誘導(dǎo)椎間盤(pán)退變模型，將兔椎間盤(pán)機(jī)械和生化特性的變化與T2值相關(guān)聯(lián)，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)GAG的含量有重要作用。但Marinelli等[3]對(duì)人尸體研究發(fā)現(xiàn)，T2值與髓核含水量顯著相關(guān)(r=-0.81，P<0.01)，與PG(r=-0.57，P<0.01)含量相關(guān)性較弱。作者認(rèn)為這可能是由于尸體標(biāo)本數(shù)較少，且尸體標(biāo)本經(jīng)歷了多次解凍和冷凍循環(huán)，導(dǎo)致線(xiàn)性回歸結(jié)果不準(zhǔn)確。

椎間盤(pán)退變的病理改變還包括各型膠原纖維的變化，主要是Ⅰ型膠原纖維持續(xù)上升，Ⅱ型膠原逐漸下降，且改變主要發(fā)生在退變晚期。椎間盤(pán)各型膠原纖維的變化可能也會(huì)影響T2值。Sun等[17]發(fā)現(xiàn)就研究發(fā)現(xiàn)T2值不僅與PG基因表達(dá)(r=-0.85)具有顯著相關(guān)性，而且還與Ⅱ型膠原纖維基因的表達(dá)水平(r=0.78)具有較高的相關(guān)性，這可能是由于Ⅱ膠原纖維改變可導(dǎo)致GAG減少，GAG減少導(dǎo)致髓核內(nèi)水分丟失，T2值減小，也可能是由于各型膠原纖維改變本身就會(huì)導(dǎo)致T2值降低，具體機(jī)制目前尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

綜上可知，T2-mapping成像可以無(wú)創(chuàng)檢測(cè)髓核GAG和水分含量的變化，而椎間盤(pán)退變?cè)缙谧钪饕淖兓荊AG和水分丟失[13,18-20]，因此T2-mapping可以通過(guò)測(cè)定T2值發(fā)現(xiàn)無(wú)明顯形態(tài)學(xué)改變的早期椎間盤(pán)退變，為診斷早期椎間盤(pán)退變提供重要的參考依據(jù)并指導(dǎo)臨床早期干預(yù)。但T2-mapping在檢測(cè)髓核Ⅱ型膠原纖維變化方面的價(jià)值尚存在爭(zhēng)議。

本研究結(jié)果顯示，髓核組織學(xué)退變?cè)u(píng)分與T2*值呈中度負(fù)相關(guān)，這與Detiger等[21]的結(jié)果基本一致。本研究結(jié)果還顯示髓核組織學(xué)退變?cè)u(píng)分2、3、4分之間T2*值的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，這與Welsch等[12]和Detiger等[21]發(fā)現(xiàn)Pfirrmann分級(jí)Ⅰ級(jí)與Ⅱ級(jí)之間T2*值的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果相一致，表明與T2-mapping比較，T2*-mapping在診斷早期椎間盤(pán)退變的價(jià)值較低。作者認(rèn)為可能由以下幾個(gè)原因?qū)е拢孩僖陨涎芯恐蠺2*-mapping成像選擇的回波時(shí)間短于計(jì)算的T2*值，這可能導(dǎo)致實(shí)際T2*測(cè)量值偏低，從而影響與椎間盤(pán)組織退變?cè)u(píng)分相關(guān)性的分析結(jié)果；②額外的去相位效應(yīng)干擾了T2*值對(duì)髓核生物化學(xué)改變的反映能力。Hoppe等[13]認(rèn)為T(mén)2*-mapping成像可以定量評(píng)價(jià)早期椎間盤(pán)退變GAG和水含量的變化，郭智萍等[22]發(fā)現(xiàn)髓核T2*值與Pfirrmann分級(jí)呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)，上述研究者均認(rèn)為T(mén)2*-mapping在診斷早期椎間盤(pán)退變具有較高的價(jià)值，與本研究結(jié)果不一致，這與以上研究中均以常規(guī)MRI分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)作為參考標(biāo)準(zhǔn)，沒(méi)有獲得組織病理學(xué)結(jié)果有關(guān)。

另外，本研究結(jié)果顯示髓核組織學(xué)退變?cè)u(píng)分5、6分之間T2*值的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這可能是由于髓核組織學(xué)退變5分與6分之間的主要差別在于髓核外基質(zhì)的凝結(jié)程度不同，導(dǎo)致纖維結(jié)構(gòu)紊亂程度明顯不同，從而導(dǎo)致其T2*值出現(xiàn)顯著差異。T2*-mapping成像可能在膠原纖維組織的識(shí)別中具有潛力，如Detiger等[21]研究發(fā)現(xiàn)前纖維環(huán)與后纖維環(huán)T2*值的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)在脊椎抵抗屈伸和旋轉(zhuǎn)等運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的能力時(shí)，后纖維環(huán)受到更多的應(yīng)力，導(dǎo)致膠原纖維結(jié)構(gòu)紊亂，從而導(dǎo)致T2*值降低；Zhang等[23]研究中也發(fā)現(xiàn)Pfirrmann Ⅰ級(jí)與Ⅱ級(jí)之間椎間盤(pán)纖維環(huán)的T2*值具有顯著差異。但由于本研究中采用兔子來(lái)建立椎間盤(pán)退變模型，其椎間盤(pán)的纖維環(huán)較小，測(cè)量會(huì)存在較大誤差，因此未對(duì)纖維環(huán)T2*值的變化進(jìn)行探討，還有待今后進(jìn)一步完善。綜上可知，T2*-mapping可以在一定程度上定量評(píng)估椎間盤(pán)退變，但是T2*值與髓核組織學(xué)評(píng)分、常規(guī)MRI分級(jí)之間的相關(guān)性強(qiáng)弱尚存在爭(zhēng)議，其在診斷早期椎間盤(pán)退變的價(jià)值也有待進(jìn)一步探究。此外，諸多研究認(rèn)為T(mén)2*-mapping成像在識(shí)別膠原組織結(jié)構(gòu)改變方面具有較大的潛力。

在本研究中，T2值(r=-0.794，P<0.01)的相關(guān)性高于T2*值(r=-0.615，P<0.01)，提示T2-mapping較T2*-mapping對(duì)椎間盤(pán)退變的等級(jí)判斷更加敏感。本研究結(jié)果顯示，髓核組織學(xué)退變?cè)u(píng)分2分與4分、3分與4分之間T2值的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而T2*值的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示T2-mapping成像在早期椎間盤(pán)的診斷中具有較高的價(jià)值。髓核組織學(xué)評(píng)分5分與6分之間T2值的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而T2*值的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示T2*-mapping可能在識(shí)別椎間盤(pán)纖維化程度方面具有較高的診斷價(jià)值。T2-mapping和T2*-mapping均可以提供可靠的椎間盤(pán)退變的生物化學(xué)改變信息。相比于T2*-mapping，T2-mapping在評(píng)估早期椎間盤(pán)退變中具有更高的價(jià)值，但是T2*-mapping較T2-mapping具有掃描時(shí)間短、圖像信噪比高和空間分辨率高等優(yōu)點(diǎn)[12]。T2和T2*值依賴(lài)于微觀(guān)組織結(jié)構(gòu)的改變，更容易受磁敏感效應(yīng)的影響[24]。

本研究尚有一些不足之處：僅選取了正中矢狀面這一個(gè)層面進(jìn)行數(shù)據(jù)測(cè)量，而每只兔子以及每個(gè)椎間盤(pán)在接近中線(xiàn)區(qū)域的形態(tài)和成分可能不一樣，最后得到的T2和T2*值可能會(huì)有偏倚；使用了HE染色和番紅O-固綠染色觀(guān)察髓核細(xì)胞及其基質(zhì)的情況，尚需進(jìn)一步在電鏡下觀(guān)察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和進(jìn)行免疫組化分析，進(jìn)一步分析T2和T2*值與MRI表現(xiàn)的關(guān)系。