蔡錦雄，江 坤，陳顏清，劉 敏，李玉蘭

（深圳市藥品檢驗(yàn)研究院/深圳藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518057）

復(fù)方氨酚美沙糖漿為復(fù)方制劑，含有對(duì)乙酰氨基酚、氫溴酸右美沙芬、鹽酸甲基麻黃堿、愈創(chuàng)甘油醚和馬來(lái)酸氯苯那敏5 個(gè)藥物活性成分，臨床用于普通感冒或流行性感冒引起的發(fā)熱、頭痛、四肢酸痛、打噴嚏、流鼻涕和咳嗽等癥狀。處方中對(duì)乙酰氨基酚用量較大，在《中國(guó)藥典》[1]2020 年版（二部）中，含對(duì)乙酰氨基酚的品種，控制的主要雜質(zhì)均有對(duì)氨基酚。對(duì)氨基酚毒性較大，其主要來(lái)源為合成過(guò)程中的原料殘留或貯藏過(guò)程中降解產(chǎn)生[2，3]，而復(fù)方氨酚美沙糖漿的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)[4]中，未對(duì)其進(jìn)行控制。本文參考《中國(guó)藥典》對(duì)乙酰氨基酚品種相關(guān)方法，建立了高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方氨酚美沙糖漿中對(duì)氨基酚含量的方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters e2695-2998 高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世公司）；XS205DU 電子天平（瑞士梅特勒公司），UW620H 電子天平（日本島津公司）；Milli-Q Reference 純水器（德國(guó)默克密理博公司）。

1.2 材料 對(duì)氨基酚對(duì)照品（中國(guó)藥品檢驗(yàn)研究院，批號(hào)100802-201604，含量100%）；乙酸銨（阿拉丁，阿拉丁，批號(hào)C1915017），甲醇（色譜純，德國(guó)默克公司，批號(hào)I1095607022）；復(fù)方氨酚美沙糖漿（國(guó)內(nèi)某公司，批號(hào)19111712、19111812、19111912）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent SB C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A 為0.05 mol/L 醋酸銨溶液，流動(dòng)相B 為甲醇，按表1 進(jìn)行梯度洗脫；流速為1.0 ml/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為20 μl；檢測(cè)波長(zhǎng)為231 nm。

表1 HPLC 梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 取對(duì)氨基酚對(duì)照品15 mg，精密稱定，至100 ml 量瓶中，加溶劑0.05 mol/L 醋酸銨-甲醇（90∶10）使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 ml，至50 ml 量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻。

2.2.2 供試品溶液制備 用內(nèi)容量移液管精密量取本品1 ml，置5 ml 量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻。

2.2.3 靈敏度溶液制備 精密量取對(duì)照品溶液1 ml，置10 ml 量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻。

2.2.4 分離度溶液制備 精密量取等量對(duì)照品溶液和供試品溶液，混合均勻。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別取分離度溶液和靈敏度溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，在分離度溶液中，對(duì)氨基酚的保留時(shí)間約為4.9 min，與相鄰雜質(zhì)峰的分離度均大于5.0，理論板數(shù)為8108，拖尾因子為1.5；在靈敏度溶液中，對(duì)氨基酚峰的信噪比為24。

圖1 分離度溶液色譜結(jié)果

2.4 專屬性試驗(yàn) 分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖2，結(jié)果顯示空白溶劑對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

圖2 專屬性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 線性關(guān)系試驗(yàn) 精密稱取對(duì)氨基酚對(duì)照品約15 mg，加溶劑并稀釋制成濃度為0.30～15.18 μg/ml 的系列溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示，對(duì)氨基酚在0.30～15.18 μg/ml 濃度范圍內(nèi)線性良好，線性回歸方程為y=72270.4x-983.8，相關(guān)系數(shù)r=1.000。

2.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 精密量取本品（批號(hào)19111712）1 ml，置5 ml 量瓶，分別加入濃度為15 μg/ml 對(duì)氨基酚溶液0.8、1.0 和1.2 ml，加溶劑稀釋至刻度，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，依法計(jì)算回收率，結(jié)果顯示，平均回收率為100.30%，RSD 為0.90%（n=9）。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 本品（批號(hào)19111712）6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，6 份供試品溶液均未檢出對(duì)氨基酚峰，方法重復(fù)性良好。

2.8 檢測(cè)限及定量限試驗(yàn) 取“2.5”線性溶液依法稀釋，作為檢測(cè)限和定量限溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，對(duì)氨基酚的檢測(cè)限為0.1 μg/ml（0.002%），定量限為0.2 μg/ml（0.005%）。

2.9 耐用性 取3 根不同型號(hào)的色譜柱（Agilent SB C18、WatersXBridgeC18 和Kromasil 100-5C18，規(guī)格均為4.6 mm×250 mm，5 μm），在3 臺(tái)不同品牌儀器上，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定系統(tǒng)適用性溶液，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示該法耐用性良好。

表2 耐用性結(jié)果

2.10 穩(wěn)定性 取對(duì)照品溶液，在樣品倉(cāng)溫度為15 ℃條件下，連續(xù)考察12 h，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，對(duì)照品溶液隨著時(shí)間的推移，對(duì)氨基酚峰峰面積逐漸減小，在3 h 內(nèi)穩(wěn)定，溶液需臨用新制。

2.11 樣品測(cè)定 取3 批樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示3 批樣品均為檢出對(duì)氨基酚峰。

3 討論

液相色譜方法的確定高效液相色譜法的基本原理是在高壓力下，利用不同組分與固定相和液體流動(dòng)相作用力不同，實(shí)現(xiàn)分離的色譜方法。目前已成為藥物分析與藥品檢驗(yàn)的主流分析方法[5]。復(fù)方氨酚美沙糖漿為復(fù)方抗感冒藥品，其處方中具有解熱鎮(zhèn)痛的對(duì)乙酰氨基酚組分含量最高，而對(duì)氨基酚為對(duì)乙酰氨基酚的主要雜質(zhì)，且該雜質(zhì)毒性較大[6，7]，需進(jìn)行控制。故建立了高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方氨酚美沙糖漿中的對(duì)氨基酚含量。

流動(dòng)相系統(tǒng)選擇在《中國(guó)藥典》2020 年版二部中，對(duì)氨基酚的檢查項(xiàng)下，流動(dòng)相系統(tǒng)主要有磷酸鹽（含四丁基氫氧化銨）-甲醇系統(tǒng)、磷酸鹽（pH4.5）-甲醇系統(tǒng)、醋酸銨-甲醇系統(tǒng)和辛烷磺酸鈉（pH3.0）-乙腈系統(tǒng)。經(jīng)考察，在0.05 mol/L 醋酸銨-甲醇（85∶15）系統(tǒng)中，對(duì)氨基酚峰峰型良好，與相鄰色譜峰分離較好。但對(duì)氨基酚峰出峰較早，且本品處方組成復(fù)雜，右美沙芬等在該系統(tǒng)中保留能力較強(qiáng)，故將起始流動(dòng)相優(yōu)化為0.05 mol/L 醋酸銨-甲醇（90∶10），使對(duì)氨基酚峰出峰時(shí)間更適宜，并將系統(tǒng)進(jìn)一步優(yōu)化為梯度系統(tǒng)，使方法準(zhǔn)確性和耐用性等更佳。

檢測(cè)波長(zhǎng)選擇采用二極管陣列檢測(cè)器，考察對(duì)氨基酚對(duì)照品溶液和加標(biāo)供試品溶液，其對(duì)氨基酚峰的3D 圖譜顯示，在231、297 nm（或298 nm）有最大吸收峰，其中，231 nm 吸收峰強(qiáng)度更高，且在該波長(zhǎng)下，無(wú)其他色譜峰干擾，故選擇測(cè)定波長(zhǎng)為231 nm。

溶劑的選擇查看《中國(guó)藥典》2020 年版二部測(cè)定對(duì)氨基酚的該流動(dòng)相體系，溶劑均采用流動(dòng)相，經(jīng)進(jìn)一步試驗(yàn)，使用0.05 mol/L 醋酸銨-甲醇（90∶10）作為溶劑時(shí)，對(duì)氨基酚對(duì)照品和供試品溶液均能完全溶解，且方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示，該溶劑滿足試驗(yàn)要求。

綜上所述，本試驗(yàn)中采用高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方氨酚美沙糖漿中對(duì)氨基酚的含量，方法操作簡(jiǎn)單、靈敏、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于該制劑的質(zhì)量控制。