李 敏 黃炳熾 彭家杰 胡健聲 洪偉彬 莫鉆蘭 黃潔瑩

廣東省東莞市動物疫病預防控制中心，廣東東莞523000

錦鯉皰疹病毒病，是由錦鯉皰疹病毒（Koi her?pevirus，KHV）所引起的致死率80%～100%的流行性疾病，僅感染錦鯉、鯉及其變種[1-4]。該病被我國列在《一、二、三類動物疫病病種名錄》中的二類疫病，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須申報的疫病[5]。1998年，該病首次由德國和以色列學者發(fā)現(xiàn)，中國香港于2001年發(fā)生首例，隨后在印度尼西亞、日本等東南亞國家相繼發(fā)生，現(xiàn)已流行于世界各地[6-7]。

水產(chǎn)行標《SC/T 7212.1-2011》作為此次錦鯉皰疹病毒病病原檢測能力測試的依據(jù)和實驗室檢測的主要方法，屬于傳統(tǒng)聚合酶鏈式反應（PCR），具有靈敏度高、準確率高等優(yōu)點，但在實際應用中，需要TK、Sph基因PCR、電泳和產(chǎn)物測序，存在檢測時間長、操作繁瑣且易污染、不能準確定量等問題。熒光定量PCR 檢測耗時短、操作簡便、能定量等優(yōu)點被廣泛應用于病原體檢測[8-10]，越來越多商品化的熒光定量PCR 試劑盒被研發(fā)出來。因此，本試驗擬通過此次病原檢測能力測試的樣本來驗證不同廠家生產(chǎn)的試劑盒的性能。

1 材料與方法

1.1 材 料

1）樣品。樣品編號為K34-1、K34-2、K34-3、K34-4，由中國檢驗檢疫科學研究院提供，4 份樣品均為魚內(nèi)臟組織勻漿上清樣品，采用凍存管包裝。本次試驗使用的陽性標準物質(zhì)由中國檢驗檢疫科學研究院提供。

2）試劑。海洋動物組織基因組DNA 提取試劑盒（批號：S8107）、PCR MasterMix（批號：KT201-02）購自天根公司；引物（批號：211044344）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；DL1000 DNA Mark?er（批號：ATG1607A）購自TaKaRa；50×TAE（批號：690674223）、gelred 核酸染料（批號：BS354B）購自biosharp；瓊脂糖（批號：E24567B127）購自biofroxx；3種商品化的錦鯉皰疹病毒實時熒光PCR 檢測試劑盒分別來自不同生產(chǎn)廠家，用A（批號：200603）、B（批號：67052）、C（批號：JC0069202006）來代替。

3）儀器設備。生物安全柜、梯度PCR 儀、水平電泳系統(tǒng)、凝膠成像儀、熒光PCR 儀、實時熒光定量PCR儀。

1.2 方 法

1）采用本次能力測試要求的方法檢測。按照中國檢驗檢疫科學研究院下發(fā)的《能力測試作業(yè)指導書》，結合水產(chǎn)行業(yè)標準《鯉皰疹病毒檢測方法第1 部分：錦鯉皰疹病毒》（SC/T 7212.1-2011）進行試驗及鑒定。

①核酸提取。參照天根DNA 提取試劑盒的說明書提取KHV核酸。

②PCR 反應。試驗所需的KHVTK基因、Sph基因所需的特異性引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，根據(jù)實際用滅菌水稀釋成10 mmol/L儲藏液，-20 ℃保存?zhèn)溆?，引物序列和反應程序見?。按PCR MasterMix 說明書標示的反應體系配制反應液，分裝到0.2 mL PCR 管，分別加入相應體積的陰性對照、待檢樣品和陽性對照，做好記錄。混勻后離心，進行PCR 擴增反應，陽性標準物質(zhì)由中國檢驗檢疫科學研究院提供。

表1 KHV PCR檢測所需的引物、反應程序

③瓊脂糖凝膠電泳。凝膠用1×TAE 電泳緩沖液配制0.01%的瓊脂糖（含10 000*superRed 核酸染料）平板，凝固后放入水平電泳槽，使電泳緩沖液剛好淹沒膠面。將上述5μL PCR產(chǎn)物加入點樣孔，使用DNA 1 000作對照。110 V 電泳約25 min，放置凝膠成像儀中觀察電泳片段的數(shù)量和位置。

④核酸測序。將KHVTK基因、Sph基因PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

2）商品化的錦鯉皰疹病毒實時熒光定量PCR檢測。以本次參測盲樣為樣品，從市場上選取3家不同廠家生產(chǎn)的實時熒光定量PCR檢測試劑盒檢測（由A、B、C代替）進行試驗與分析，3種試劑盒的試驗成立標準、結果判定標準各不相同（詳見表2）。按照各自試劑盒說明書配置熒光PCR反應體系，依次加入陰性對照、樣品核酸和陽性對照，加樣后及時蓋緊管蓋，做好標記，混勻后離心，按照各自的反應程序擴增。

表2 不同試劑盒的反應體系、反應時間、試驗成立和結果判定標準

2 結果與分析

按照中國檢驗檢疫科學研究院下發(fā)的《能力測試作業(yè)指導書》，結合水產(chǎn)行業(yè)標準《鯉皰疹病毒檢測方法第1 部分：錦鯉皰疹病毒》（SC/T 7212.1-2011）對樣品進行檢測。檢測結果顯示：樣品K34-2、K34-3 為KHV 核酸陽性，樣品K34-1 和K34-4 核酸陰性，檢測結果為滿意。

2.1 按本次能力測試要求的方法檢測的結果

如圖1所示：樣品K34-2、K34-3的TK、Sph基因的PCR 產(chǎn)物分別出現(xiàn)了409 bp 片段和292 bp 片段，并將PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序同源性比對表明：該基因序列與Genbank 登錄的鯉皰疹病毒3 型T 鏈的全基因序列MG925491.1 有99%的同源性（表3）。樣品K34-1 和K34-4 未出現(xiàn)DNA 片段。樣品K34-1 和K34-3的TK 基因和Sph 基因根據(jù)《鯉皰疹病毒檢測方法SC/7212.1-2011》綜合判定：測試樣品k34-2 和k34-3均為KHV陽性。

表3 PCR產(chǎn)物的測序結果

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖譜

2.2 商品化的錦鯉皰疹病毒實時熒光qPCR結果

各試驗陰、陽對照符合說明書的試劑成立標準，試驗均成立。試驗發(fā)現(xiàn)：B、C試劑未檢出陽性樣品；A試劑的擴增曲線圖中呈現(xiàn)2條陽性對照擴增曲線，其中，一條擴增曲線為KHV陽性對照，另一條擴增曲線為CyHV-2（鯉皰疹病毒）陽性對照，A 試劑檢測出K34-2 和K34-3 這兩條擴增曲線，其Ct 值分別為19.84、19.57，因此可判K34-2 和K34-3 為KHV 核酸陽性。A試劑檢測的結果與能力測試結果一致（圖2）。

圖2 不同試劑的擴增曲線圖

3 討 論

23～25 ℃是KHV 發(fā)病的最適溫度，但有研究發(fā)現(xiàn)：KHV 已具備在平均溫度3 ℃的冰下繁殖的能力[11]且尿液是KHV的主要傳播途徑[2]。KHV潛伏期長、傳染性強、致死率高，且缺乏對KHV有效的治療方案和預防措施。為了加強水生動物防疫系統(tǒng)實驗室能力建設，提升實驗室對水生動物病原檢測的能力，越來越多的實驗室配備了熒光定量PCR 儀，具備開展熒光定量PCR 檢測的條件。實時熒光定量PCR 技術由美國Applied Biosystems 公司于1996年推出，具有特異性強、靈敏度高、準確可靠、無污染、實時性好且能實現(xiàn)多重反應等特點[21]。隨著檢測技術的不斷發(fā)展，許多商品化的錦鯉皰疹病毒實時熒光定量PCR 檢測試劑盒已被研發(fā)。本試驗選取3 種試劑盒，以此次病原檢測能力測試的樣本為檢測對象進行試劑比對發(fā)現(xiàn)：3 種檢測試劑的試驗均成立，只有A 與能力測試結果一致。因此，選用商品化試劑盒時，試劑比對尤為重要。