陳佩佩,陳琳珊,陳 茹
(1.廣東省食品工業(yè)公共實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 511442;2.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司,廣東廣州 511442;3.廣東省質(zhì)量監(jiān)督食品檢驗(yàn)站,廣東廣州 511442)
黃曲霉毒素(Aflatoxin,AFT)是由黃曲霉和寄生曲霉等某些菌株產(chǎn)生的一類(lèi)次生代謝物[1],從化學(xué)結(jié)構(gòu)上,均屬于雙呋喃香豆素衍生物,是一類(lèi)毒性極強(qiáng)的雙呋喃環(huán)類(lèi)毒素。由于AFT產(chǎn)生菌在自然界中廣泛存在,很多的動(dòng)植物源性食品都有可能存在污染[2],尤其在植物的種植、加工、運(yùn)輸、儲(chǔ)存等過(guò)程都有可能被產(chǎn)生菌污染,從而產(chǎn)生毒素[3]。同時(shí),黃曲霉毒素在自然條件下穩(wěn)定性較強(qiáng),極性較低,難以用水或紫外線完全除去,只有在強(qiáng)堿性條件下容易分解[4],過(guò)多的攝入引起致癌、致畸和致突變等毒性效應(yīng)[5],其中以黃曲霉毒素B1的毒性致癌性最強(qiáng)。近年來(lái),我國(guó)黃曲霉毒素污染事件頻繁發(fā)生,因此,建立高效、通用、靈敏的相關(guān)檢測(cè)方法,對(duì)企業(yè)生產(chǎn),消費(fèi)者安全都有十分重要的意義。
目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)黃曲霉毒素的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[6-7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-9]或液相色譜-高分辨質(zhì)譜法[10]、免疫學(xué)檢測(cè)法[11-12]。高效液相色譜法操作煩瑣,盡管檢測(cè)器靈敏度高,但雜質(zhì)多,分析時(shí)間較長(zhǎng),免疫學(xué)檢測(cè)法雖然能大批量檢測(cè),但易與類(lèi)似結(jié)構(gòu)的化合物發(fā)生反應(yīng),出現(xiàn)假陽(yáng)性,結(jié)果偏差較大。質(zhì)譜法應(yīng)用較廣,前處理簡(jiǎn)單,定性定量能力好,但高分辨質(zhì)譜價(jià)格昂貴,難以廣泛應(yīng)用。本文以分散液液微萃取為前處理手段,建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)茶飲料中的黃曲霉毒素B1和B2進(jìn)行測(cè)定。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明,方法整體方便快捷,靈敏度高,回收率好,可日常大批量檢測(cè)。
API4000Q質(zhì)譜儀、島津LC-20AD液相色譜系統(tǒng)、4k-15離心機(jī)、IKA Vortex4渦旋混勻器、Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)。
茶飲料,廣州市售;黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2,純度大于98%,德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司;甲酸、乙腈、3-氯苯胺、三氯甲烷,均為HPLC級(jí),美國(guó)Thermo Fisher公司;鹽酸、磷酸鈉,均為分析純,廣州試劑廠;實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。
于15 mL尖底離心管中加入1 mL 2 mol/L的鹽酸溶液和50 μL 3-氯苯胺充分混勻,然后加入5 mL樣品,渦旋提取10 min,使用1 mol/L的磷酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6,渦旋混勻后置于離心機(jī)中以4 500 r/min離心5 min,使3-氯苯胺沉淀。除去上層水相,下層3-氯苯胺用乙腈定容至200 μL,待測(cè)定。
標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:分別準(zhǔn)確稱(chēng)取黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素B2標(biāo)準(zhǔn)品各0.050 0 g于100 mL棕色具塞容量瓶中,用乙腈稀釋成500 mg/L的儲(chǔ)備液。
標(biāo)準(zhǔn)中間溶液:用乙腈將上述儲(chǔ)備液稀釋成濃度為10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液。
溶劑曲線:使用乙腈配制成1.0 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L 和 100 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)使用液,繪制校準(zhǔn)曲線。
基質(zhì)曲線:使用空白烏龍茶基質(zhì)液配制校準(zhǔn)曲線,濃度點(diǎn)與溶劑曲線相同。
1.5.1 色譜條件
色譜柱:Xbridge BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,3.0 μm);進(jìn)樣體積:10 μL;流速0.5 mL/min;柱溫:35 ℃;流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%甲酸(B);等度洗脫程序:0.0~5.0 min,75% A。
1.5.2 質(zhì)譜條件
離子源:ESI源;離子化模式:電噴霧電離源正模式(ESI+);氣簾氣壓:241 kPa;毛細(xì)管電壓:5 500 V;離子源溫度(TEM):550 ℃;霧化氣壓力:345 kPa;加熱輔助氣壓力:345 kPa;碰撞氣(CAD):中等;采集模式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式。
根據(jù)黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素B2的化學(xué)結(jié)構(gòu),其含有較多含O基團(tuán),在離子化過(guò)程中傾向于得到質(zhì)子,因此分別以其相對(duì)分子質(zhì)量加上H+質(zhì)量,初步確定母離子質(zhì)荷比。以混合流動(dòng)相的流動(dòng)注射的方式向離子源注射標(biāo)準(zhǔn)溶液,在m/z313.1和m/z315.1處,均得到較高響應(yīng)的[M+H]+離子,同時(shí)以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式采集二級(jí)碎片。進(jìn)一步優(yōu)化去簇電壓DP和碰撞電壓CE,得到較優(yōu)響應(yīng),二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1,詳細(xì)質(zhì)譜信息見(jiàn)表1。
表1 黃曲霉毒素B1、B2質(zhì)譜數(shù)據(jù)
圖1 黃曲霉毒素的二級(jí)質(zhì)譜圖
分散液液微萃取過(guò)程中,加入分散劑和待測(cè)樣液互溶,加入萃取劑振蕩形成微小的液滴,這些液滴在移動(dòng)的過(guò)程中于對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行連續(xù)萃取,形成水/分散劑/萃取劑形成均相乳濁液體系,快速完成分析物在水溶液與萃取劑之間的分配平衡。選擇鹽酸作為分散劑。在本實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)分散劑用量小于0.6 mL時(shí),提取回收率低于70%,使用量為1.0 mL時(shí),回收率達(dá)到最高,隨著使用量提高至1.2 mL,回收率有所回降。所以鹽酸分散劑用量選取為1.0 mL。詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)圖2。
圖2 分散劑體積對(duì)回收率的影響
在分散劑體積為1 mL的條件下,分別用30 μL、50 μL、70 μL、90 μL、110 μL和130 μL的3-氯苯胺進(jìn)行萃取,考察了不同體積的萃取劑對(duì)萃取回收率的影響,結(jié)果如圖3所示。隨著3-氯苯胺體積增大,回收率也增大,而當(dāng)體積大于50 μL時(shí),回收率增大不明顯,而且3-氯苯胺的使用體積越大,pH回調(diào)的幅度也越大,實(shí)驗(yàn)更耗時(shí),最終定容液3-氯苯胺的占比也越大,對(duì)于含有甲酸的流動(dòng)相體系,容易造成溶劑效應(yīng),使峰型變差。因此,最終確定3-氯苯胺50 μL為最佳萃取體積。
圖3 萃取劑體積對(duì)回收率的影響
市售的茶飲料會(huì)添加糖、色素、酸度調(diào)節(jié)劑或其他添加劑,且含量遠(yuǎn)超于黃曲霉毒素可能存在的含量,加上茶葉本身含有較多的天然物,因此有可能造成較嚴(yán)重的基質(zhì)效應(yīng)(ME),使定量結(jié)果偏差較大。為了探究實(shí)驗(yàn)實(shí)際存在的基質(zhì)效應(yīng),分別用空白基質(zhì)液和乙腈配制了基質(zhì)曲線和純?nèi)軇┣€,并以基質(zhì)曲線和純?nèi)軇┣€的斜率比ME值為判斷依據(jù),當(dāng)ME在80%~120%時(shí),則說(shuō)明基質(zhì)效應(yīng)不明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素B2的ME值分別為23.2%和26.5%,說(shuō)明基質(zhì)負(fù)效應(yīng)明顯,因此最終選擇使用基質(zhì)曲線進(jìn)行定量,以校正基質(zhì)效應(yīng)造成的偏差。
使用空白基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性范圍為1.0~100 μg/L,將該曲線于優(yōu)化后的條件下測(cè)定,以質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo),峰面積(Y)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)以信噪比S/N=3和信噪比S/N=10分別確定方法的檢測(cè)限與定量限。黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素B2定量離子流圖見(jiàn)圖4。
圖4 黃曲霉毒素提取離子流色譜圖
結(jié)果表明,黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素B2的相關(guān)系數(shù)r分別為0.999 6和0.999 3,基質(zhì)曲線方程分別為Y=5 050X+2 240和Y=3 090X+2 750,檢測(cè)限均為20.0 ng/kg,定量限均為50.0 ng/kg。由分析結(jié)果可知,本方法定量能力好,檢出限低,可有效對(duì)茶飲料中的黃曲霉毒素進(jìn)行定量分析。
分別對(duì)市售的3種茶飲料(綠茶、烏龍茶、紅茶)進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果均為陰性。使用該樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。每種樣品均按照定量限的1倍、2倍和10倍進(jìn)行添加,即0.05 μg/kg、0.10 μg/kg、0.50 μg/kg濃度水平,每個(gè)濃度水平在日內(nèi)平均測(cè)定6次,平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差數(shù)據(jù)(n=6)
3種樣品的平均回收率范圍在71.2%~91.0%,RSD范圍在2.23%~6.43%,方法回收率、精密度及準(zhǔn)確度良好,可用于實(shí)際樣品的測(cè)定。
以液液微萃取為基礎(chǔ),建立前處理方法,方法整體高效簡(jiǎn)單,通過(guò)調(diào)節(jié)pH,較大限度回收萃取劑,提高了回收率;建立UPLC-MS/MS法,優(yōu)化了色譜及質(zhì)譜條件,兩種黃曲霉毒素在樣3 min內(nèi)出峰,且峰型良好。使用基質(zhì)曲線對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行校準(zhǔn),降低了基質(zhì)效應(yīng)對(duì)結(jié)果的影響。回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差數(shù)據(jù)表明,方法靈敏度高、重現(xiàn)性好,可為茶飲料中毒素測(cè)定方法的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。