楊紅媛，張厚德，朱煜景，遲昕宜，牛銳利，譚冰，宗憲春

(牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

紫蘇(PerillafrutesceusL.Britt)為唇形科(Labiatae)一年生草本植物，具特異芳香，是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食、油料作物，也是衛(wèi)生部第一批規(guī)定的既是藥品又是食品的60種作物之一，是一種極具開(kāi)發(fā)利用的天然產(chǎn)物。目前有關(guān)紫蘇組織培養(yǎng)及快繁技術(shù)雖然取得了一些進(jìn)展，但如何建立起一套完善的高頻的紫蘇離體快繁體系研究的還不夠深入。本研究以紫蘇為材料，通過(guò)對(duì)其子葉、下胚軸、幼嫩葉片最佳外植體的篩選、愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化及生根培養(yǎng)，建立紫蘇的離體培養(yǎng)再生體系，為紫蘇種質(zhì)資源保存及快速繁殖提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本文使用的紫蘇種子購(gòu)買(mǎi)于牡丹江花鳥(niǎo)魚(yú)市場(chǎng)，產(chǎn)于哈爾濱金龍農(nóng)業(yè)有限公司。所使用的激素：6-BA(6-benzylaminopurine，6-芐基嘌呤)、NAA(1-naphthyla-cetic acid，萘乙酸)，IAA(Indolyl-3-acetic acid，吲哚乙酸)均為北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同消毒時(shí)間處理對(duì)紫蘇種子萌發(fā)的影響。將紫蘇種子在清水中浸泡6 h，然后放入0.1%的升汞中分別消毒4、6、8、10、12 min；然后將種子取出，用無(wú)菌水沖洗5次，再將種子播種在裝有事先配制好的MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中。整個(gè)過(guò)程均在無(wú)菌超凈工作臺(tái)進(jìn)行。培養(yǎng)15 d后觀(guān)察并統(tǒng)計(jì)種子的污染率和發(fā)芽率。篩選消毒的最佳時(shí)間。

1.2.2 培養(yǎng)基種類(lèi)不同對(duì)紫蘇種子萌發(fā)的影響。用0.1%的升汞對(duì)紫蘇種子消毒8 min，無(wú)菌水沖洗5次后將種子分別播種到盛有MS和1/2MS培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，15 d后觀(guān)察并計(jì)算種子的發(fā)芽率。篩選適合種子生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基。

1.2.3 愈傷組織誘導(dǎo)。下胚軸長(zhǎng)約4 cm、子葉展開(kāi)時(shí)，將下胚軸切成1.0 cm的小段，將子葉切成0.5 cm×0.5 cm的小塊。將無(wú)菌苗的幼葉也切成0.5 cm×0.5 cm的小塊，然后接種在6-BA(1.0、2.0、3.0 mg/L)和NAA(0.1、0.2、0.3 mg/L)不同配比的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，見(jiàn)表2-1。每種培養(yǎng)基接20個(gè)外植體，每處理重復(fù)3次。3 d后觀(guān)察外植體的變化和愈傷組織的生長(zhǎng)狀況。35 d后計(jì)算愈傷組織的誘導(dǎo)率。

1.2.4 愈傷組織的分化培養(yǎng)。將子葉和葉片形成的愈傷組織轉(zhuǎn)接至6-BA(1.0、2.0、3.0 mg/L)和NAA(0.1、0.2、0.3 mg/L)不同配比的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，具體見(jiàn)表1。每種培養(yǎng)基分別接種20個(gè)愈傷組織，重復(fù)相同處理程序，共3次。成長(zhǎng)35 d后觀(guān)察培養(yǎng)基，比較來(lái)自不同外植體(子葉，葉片)的愈傷組織分化情況，并計(jì)算不同外植體的愈傷組織的分化率。

表1 愈傷組織誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)基的激素組成

1.2.5 試管苗的生根。當(dāng)不定芽長(zhǎng)至約2～3 cm高時(shí)，轉(zhuǎn)到附加不同激素IAA(0.1、0.2、0.3 mg/L)、NAA(0、0.1、0.2、0.3 mg/L)的1/2MS生根培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)生根，20 d后統(tǒng)計(jì)根的生長(zhǎng)情況并計(jì)算生根率。

1.3 培養(yǎng)條件

本試驗(yàn)以MS為基本培養(yǎng)，添加相同種類(lèi)的植物激素，控制唯一變量為激素濃度。其它附加物為30 g/L的蔗糖，6 g/L的瓊脂。用1 mol/LNaOH溶液或1 mol/LHCl調(diào)節(jié)pH至5.8左右。培養(yǎng)條件：(25±2)℃，光照強(qiáng)度1600 Lx，光照時(shí)間12 h/d。

1.4 數(shù)據(jù)處理

萌發(fā)率=(萌發(fā)的種子數(shù)/接種的種子數(shù))×100%。

污染率=(接種污染數(shù)/接種總數(shù))×100%。

出愈率=(有愈傷組織形成的外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%。

分化率=(有芽形成的外植體數(shù)/接種的愈傷組織數(shù))×100%。

生根率=(有根形成的芽數(shù)/接種芽數(shù))×100%。

測(cè)試結(jié)果的基本數(shù)據(jù)由Excel處理，使用Spss統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)測(cè)試數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時(shí)間處理對(duì)紫蘇種子萌發(fā)的影響

不同消毒時(shí)間對(duì)紫蘇種子萌發(fā)的影響見(jiàn)表2。從數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果不難發(fā)現(xiàn)，種子的消毒時(shí)間不同，后期的萌發(fā)率亦不同。用0.1%升汞消毒總時(shí)長(zhǎng)為4 min時(shí)萌發(fā)率為76%，污染率為30%；消毒總時(shí)長(zhǎng)為6 min時(shí)種子的萌發(fā)率為88%，污染率為11%、消毒總時(shí)長(zhǎng)達(dá)到8 min時(shí)萌發(fā)率最好，為94%，污染率最低，為6%；然而當(dāng)升汞消毒時(shí)間大于8 min時(shí)，種子萌發(fā)率開(kāi)始降低。污染率又逐漸升高。因此，本試驗(yàn)無(wú)菌接種時(shí)采用0.1%升汞消毒8 min。

表2 不同消毒時(shí)間對(duì)紫蘇種子萌發(fā)的影響

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)紫蘇種子萌發(fā)的影響

紫蘇種子經(jīng)8 min消毒后接種在MS和1/2MS培養(yǎng)基中，兩種培養(yǎng)基對(duì)種子萌發(fā)的影響見(jiàn)表3。由此表可知，種子在兩種培養(yǎng)基中的萌發(fā)率差異不大，也就是說(shuō)在不同培養(yǎng)基中的萌發(fā)率基本相同，但在1/2MS培養(yǎng)基中的芽纖細(xì)，故本試驗(yàn)所采用的外植體均來(lái)自MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)的無(wú)菌苗。

表3 不同培養(yǎng)基對(duì)紫蘇種子萌發(fā)的影響

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)紫蘇不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.3.1 不同培養(yǎng)基對(duì)葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響。將紫蘇葉片剪成0.5 cm×0.5 cm小塊后接入到Q1-Q9培養(yǎng)基中，葉片在不同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，3 d后觀(guān)察發(fā)現(xiàn)葉片向背面卷曲，10 d左右，從葉片邊緣漸漸出現(xiàn)愈傷組織，顏色呈現(xiàn)綠色或淺綠色。從表4可以發(fā)現(xiàn)，葉片在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其愈傷組織生長(zhǎng)狀況和誘導(dǎo)率有所不同。在培養(yǎng)基Q9即6-BA3.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L培養(yǎng)基時(shí)，其愈傷組織生長(zhǎng)旺盛、誘導(dǎo)率最高，為97.5%；在Q1培養(yǎng)基即6-BA1.0 mg/L+ NAA0.1 mg/L培養(yǎng)基上愈傷組織生長(zhǎng)一般、誘導(dǎo)率相對(duì)較低，只有45%。因此，從愈傷組織誘導(dǎo)率和生長(zhǎng)狀況來(lái)看，誘導(dǎo)紫蘇葉片愈傷組織最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA3.0 mg/L+NAA0.3 mg/L，愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為97.5%。

表4 不同培養(yǎng)基對(duì)葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.3.2 不同培養(yǎng)基對(duì)下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的影響。將紫蘇的下胚軸切成1.0 cm的小段后接入到Q1-Q9培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)5 d后，下胚軸兩端略微膨大，顏色變淺，10 d后部分外植體開(kāi)始形成愈傷組織。培養(yǎng)28 d后觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，(見(jiàn)表5)。由表5可知，不同培養(yǎng)基其愈傷組織的誘導(dǎo)率和生長(zhǎng)狀況不同。接種于Q8培養(yǎng)基時(shí)，即6-BA3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基時(shí)，外植體下胚軸的愈傷組織生長(zhǎng)較旺盛、誘導(dǎo)率相對(duì)較高為83.3%，因此確定下胚軸誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為Q8，即MS+ 6-BA3.0 mg/L + NAA0.2 mg/L。

表5 不同培養(yǎng)基對(duì)下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.3.3 不同培養(yǎng)基對(duì)子葉愈傷組織誘導(dǎo)的影響。將紫蘇子葉剪成0.5 cm×0.5 cm小塊后接入到Q1-Q9培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，6 d后子葉膨大，10 d后其邊緣形成少量愈傷組織。培養(yǎng)35 d觀(guān)察，不同培養(yǎng)基對(duì)子葉愈傷組織誘導(dǎo)率和生長(zhǎng)狀況影響見(jiàn)表6。由此表可知，子葉愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為Q9，即MS+ 6-BA 3.0 mg/L + NAA 0.3 mg/L，愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為91.7%。

表6 不同培養(yǎng)基對(duì)子葉愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.3.4 細(xì)胞分裂素6-BA和生長(zhǎng)素NAA對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響。在不同濃度6-BA和NAA配比的培養(yǎng)基上，大部分外植體都有所生長(zhǎng)，培養(yǎng)6 d時(shí)，外植體與培養(yǎng)基接觸部位開(kāi)始膨大或彎曲，下胚軸兩端顏色變淺。10 d時(shí)，子葉、下胚軸和幼嫩葉片均有愈傷組織出現(xiàn)，35 d左右，不同濃度6-BA和NAA處理的外植體，在出愈率、生長(zhǎng)狀況已表現(xiàn)出明顯的差異(見(jiàn)圖1)。從出愈時(shí)間看，下胚軸出愈傷組織時(shí)間略早，但從誘導(dǎo)率及愈傷組織的生長(zhǎng)狀況看，幼嫩葉片愈傷組織的誘導(dǎo)率高于子葉和下胚軸。當(dāng)6-BA濃度分別為 1.0、2.0、3.0 mg/L 時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)，三種外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率隨著NAA濃度的增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。當(dāng)NAA濃度分別為0.1、0.2、0.3 mg/L 時(shí)，三種外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率隨著6-BA濃度的增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在同一培養(yǎng)基(6-BA和NAA的配比相同)中培養(yǎng)三種不同的外植體，愈傷組織誘導(dǎo)率表現(xiàn)為葉片>子葉>下胚軸；當(dāng)6-BA濃度為3.0 mg/L時(shí)，NAA濃度為0.3 mg/L 時(shí)表現(xiàn)更為明顯。

圖1 細(xì)胞分裂素及生長(zhǎng)素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

綜合考慮，進(jìn)行紫蘇組織培養(yǎng)時(shí)，外植體選取其子葉和葉片較為適合。因其具有較高的誘導(dǎo)率。適宜的培養(yǎng)基為：6-BA3.0 mg/L+ NAA0.3 mg/L，誘導(dǎo)率葉片為97.5%，子葉為91.7%。

2.4 不同培養(yǎng)基對(duì)紫蘇愈傷組織分化的影響

將紫蘇子葉和幼嫩葉片誘導(dǎo)出的愈傷組織接入到原培養(yǎng)基相對(duì)應(yīng)的Q1-Q9培養(yǎng)基中培養(yǎng)。25 d后，兩種不同外植體愈傷組織分化情況見(jiàn)表7。從表中分化率可以看出：不同的培養(yǎng)基，其愈傷組織的分化率也不同。在同一水平細(xì)胞分裂素6-BA(1 mg/L、2 mg/L或3 mg/L)的作用下，葉片和子葉形成的愈傷組織的分化率隨著NAA濃度增加呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，形成生長(zhǎng)健壯的不定芽；當(dāng)NAA濃度一定時(shí)，隨著6-BA濃度增加，愈傷組織的分化率逐漸上升。6-BA濃度為3 mg/L，NAA濃度為0.3 mg/L時(shí)，此時(shí)分化率達(dá)到峰值，分化出的不定芽生長(zhǎng)健壯，葉片分化率為68.11%，子葉分化率為58.57%，均維持在較高水平，而葉片的分化率要優(yōu)于子葉。因此應(yīng)選擇高濃度的6-BA(3 mg/L)和較高濃度的生長(zhǎng)素NAA(0.2 mg/L)組合進(jìn)行愈傷組織的分化培養(yǎng)。紫蘇葉片和子葉愈傷組織分化的最佳培養(yǎng)基是Q8。即MS+6-BA3 mg/L+NAA 0.2 mg/L為篩選紫蘇愈傷組織分化的最佳培養(yǎng)基。

表7 不同培養(yǎng)基對(duì)子葉和葉片愈傷組織分化的影響

2.5 生根培養(yǎng)基的篩選

將生長(zhǎng)狀況良好株高2～3 cm的不定芽，接至R1-R7的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。從表8可知：不含生長(zhǎng)素的1/2 MS培養(yǎng)基生根率較低，生長(zhǎng)素NAA對(duì)于紫蘇不定芽的生根效果高于IBA。當(dāng)NAA的濃度為0.1 mg/L時(shí)，所有不定芽都能成功生根。且根系發(fā)達(dá)，主根明顯。因此，R2培養(yǎng)基即MS+NAA0.1 mg/L為最佳生根培養(yǎng)基。

表8 不同培養(yǎng)基對(duì)生根的影響

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)紫蘇子葉、下胚軸、幼嫩葉片最佳外植體的篩選、愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化及生根培養(yǎng)，建立了紫蘇的離體培養(yǎng)再生體系。紫蘇種子萌發(fā)最佳培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基；最佳消毒方法為0.1% 升汞消毒8 min。此時(shí)種子萌發(fā)率最高達(dá)96 %。離體培養(yǎng)最佳外植體為葉片。紫蘇葉片和子葉誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為MS+ 6-BA3.0 mg/L+NAA0.3 mg/L，誘導(dǎo)率分別為97.5%和91.7%；愈傷組織分化的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L，葉片優(yōu)于子葉。最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA0.1 mg/L，生根率為100%。