劉娜 李影 王燕一 張維 劉洪臣

近些年間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）免疫調(diào)節(jié)能力受到廣泛關(guān)注，其可以與體內(nèi)微環(huán)境互相影響，分泌多種細(xì)胞因子從而發(fā)揮調(diào)控作用［1，2］。PDLSCs作為MSCs的一種同源性的干細(xì)胞，其免疫調(diào)節(jié)能力與間充質(zhì)干細(xì)胞相似，關(guān)于PDLSCs的免疫調(diào)節(jié)功能越來越受到關(guān)注［3］。近期相關(guān)研究結(jié)果表明炎癥微環(huán)境下PDLSCs的免疫調(diào)節(jié)能力也會降低［4］。Wada等的研究發(fā)現(xiàn)人牙周膜干細(xì)胞能通過分泌可溶性因子介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)功能［5］。

T細(xì)胞能夠產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答，是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的主要細(xì)胞。免疫細(xì)胞在體外活化以后可以分泌IFNγ、TNFα等可溶性因子，能夠啟動MSCs的免疫抑制程序，從而導(dǎo)致IDO、iNOS等蛋白的大量分泌，它們的酶活性產(chǎn)物抑制了免疫細(xì)胞的功能及增殖［6-8］。此外，有研究表明在牙周組織的破壞及牙槽骨吸收中T細(xì)胞扮演重要的角色。Tian M等發(fā)現(xiàn)在慢性牙周炎患者外周血T淋巴細(xì)胞中PD-1和PDL-1呈高表達(dá)，其能夠通過負(fù)性免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)來增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)牙槽骨的吸收和破壞［9］。

然而，T細(xì)胞參與牙周炎發(fā)生發(fā)展及其與PDLSCs之間相互作用的機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗將通過外源性人重組腫瘤壞死因子構(gòu)建體外炎癥微環(huán)境，刺激PDLSCs，并與CD3+T細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測PDLSCs對CD3+T細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。

1.材料方法

1.1 樣本來源 從解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心口腔頜面外科門診收集健康第三磨牙。所有患者身體健康，無近期急性感染及服藥史?；颊吣挲g在20-35歲之間，樣本量共8例。另外，從解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心輸血科獲取人外周血白膜層細(xì)胞濃縮血樣，所有捐獻(xiàn)者身體健康，無半年內(nèi)用藥史及系統(tǒng)性疾病。樣本量共8例。本研究經(jīng)中國人民解放軍總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：IACUC-2016067)，所有患者均簽署了知情同意書。

1.2 人牙周膜干細(xì)胞分離培養(yǎng) 將本課題組獲取的新鮮離體牙樣本，使用無菌鑷子將牙齒倒置，用提前配置的PBS（含1%青鏈霉素，北京Solarbio）小心沖洗5-7次，刮取根中1/3部分牙周膜，用眼科剪將組織小心剪碎，然后置于盛有5mL預(yù)制PBS的15mL離心管中，在室溫下使用水平離心機(jī)800r/min離心5min。使用胰酶消化法（1mL EDTA-胰蛋白酶消化液（北京Solarbio）消化2-4min后終止消化）處理組織碎塊，同樣的轉(zhuǎn)速離心5min后加入5mL含血清α-MEM培養(yǎng)液（含1%青鏈霉素、10%FBS，美國Gibco）重懸，置于直徑10cm的無菌培養(yǎng)皿中，放入孵箱連續(xù)培養(yǎng)7d左右，倒置顯微鏡下可見形似成纖維細(xì)胞的紡錘形細(xì)胞爬出。待細(xì)胞長至80%匯合時傳代。采用有限稀釋法進(jìn)行克隆培養(yǎng)分離培養(yǎng)人牙周膜干細(xì)胞，具體方法步驟參考本課題組前期工作［10］。

本課題組從人健康離體牙樣本中分離培養(yǎng)出健康牙周膜干細(xì)胞標(biāo)記為：H-PDLSCs（Healthy-Periodontal ligament stem cells）；本課題組將H-PDLSCs采用10ng/mL的TNFα（美國，Peprotech）提前刺激24h作為炎癥誘導(dǎo)條件下的牙周膜干細(xì)胞，標(biāo)記為：I-PDLSCs（Inflammatory-Periodontal ligament stem cells）。

1.3 CD3+T細(xì)胞的體外分離培養(yǎng) 將全血白膜層10mL加等量預(yù)冷PBS稀釋，緩慢加入20mL人外周血淋巴細(xì)胞分離液（天津灝洋生物技術(shù)有限公司），離心（2000rpm，15min）。白膜層吸取物用PBS(加入5mL的RPMI1640培養(yǎng)液，美國Gibco）洗2次，沉淀物富含單個核細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。調(diào)整細(xì)胞密度1×107/100μL按照說明書（德國MiltenyiBiotec GmbH）流程進(jìn)行CD3+T細(xì)胞提?。喊凑?07細(xì)胞添加10μL CD3e-biotin試劑并混勻；置于4℃避光孵育10min，加入預(yù)制冷卻的PBS清洗后離心棄上清；加入1mL預(yù)制冷卻的PBS重懸，每107細(xì)胞添加20μL anti-biotin磁珠混勻，重復(fù)上述孵育及清洗離心步驟，棄上清；重懸后使用適量預(yù)制緩沖液潤濕細(xì)胞分選柱，然后用1mL預(yù)制緩沖液加力沖洗2次；將分選柱撤離磁力架后預(yù)制緩沖液沖洗2次，可獲得CD3+T細(xì)胞。隨后進(jìn)行CD3+T細(xì)胞的培養(yǎng)及活化：T細(xì)胞計數(shù)后分選適量的細(xì)胞置于離心管中，一部分按照實(shí)驗所需濃度加入配制的RPMI 1640刺激液4mL，調(diào)整細(xì)胞密度為8×105/100uL，另一部分加入配制的RPMI 1640培養(yǎng)液，分別混合均勻后置于兩個直徑6cm的培養(yǎng)皿中，標(biāo)記，放入37℃，5%CO2孵箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，用于下步實(shí)驗。

1.4 PDLSCs與CD3+T細(xì)胞共培養(yǎng) 將第三代PDLSCs消化后重懸后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)：8×104/100μL，采用48孔板（美國，Corning），每孔液體量400μL，每孔CD3+T細(xì)胞的數(shù)量均為8×105個，PDLSCs與CD3+T細(xì) 胞 的 比 例 為1∶1、1∶10、1∶20、1∶50、1∶100［11，12］。共培養(yǎng)時間為48h。10ng/mL的TNFα（美國，Peprotech）提前刺激H-PDLSCs 24h作為I-PDLSCs，在刺激24h后PBS清洗3遍隨后按比例加入相應(yīng)的CD3+T細(xì)胞。

1.5 實(shí)時定量PCR檢測CD3+T細(xì)胞凋亡及炎癥相關(guān)基因表達(dá) 共培養(yǎng)48h后，Trizol裂解細(xì)胞提取RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，日本）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，Sybr Green試劑盒進(jìn)行qRT-PCR檢測（全式金，中國），在反應(yīng)管中擴(kuò)增目的基因及管家基因（華大基因，中國），反應(yīng)體系為20μL。引物序列：TNFα，上游引物：5′-CACCACTTCGAAACCTGGGA-3′，下游引物：TGTAGGCCCCAGTGAGTTCT-3′；Caspase-3，上游引物：5′-CCTGGTTCATCCAGTCGCTT-3′，下游引物：5′-TCTGTTGCCACCTTTCGGTT-3′；Caspase-8，上 游 引 物：5′-CTGGTCTGAAGGCTGGTTGT-3′，下 游 引 物：5′-CAGGCTCAGGAACTTGAGGG-3′；IL-6，上游引物：5′-GCACAGCTCTGGCTTGTTCC-3′，下游引物：5′-TGAGGAGACTTGCCTGGTGA-3′GAPDH，上游引物：5′-TCTGACGACTCTGCTTCACG-3′，下游引物：5′-TTCAGGGCATGTGTGATGCT-3′；CCND-1，上游引物：5′-GATGCCAACCTCCTCAACGA-3′，下游引物：5′-ACTTCTGTTCCTCGCAGACC-3′；。反應(yīng)條件：95℃變性20min，95℃30s，60℃1min，40個循環(huán)。采用實(shí)時熒光定量PCR儀（Applied Biosystems 7500，美國Life Technologies公司）監(jiān)測記錄數(shù)據(jù)，重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。獨(dú)立樣本t檢驗進(jìn)行兩組間比較；多組間比較時，P值進(jìn)行Bonferroni校正。P＜0.05、P＜0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 CD3+T細(xì)胞分離培養(yǎng) 顯微鏡下T細(xì)胞被PHA活化后，CD3+T細(xì)胞呈圓形懸浮生長，細(xì)胞增殖活躍，活性良好（圖1）。

圖1 CD3+T細(xì)胞鏡下觀（×200；×400）

2.2 共培養(yǎng)對CD3+T細(xì)胞Caspase3、Caspase8基因表達(dá)的影響 將H-PDLSCs及I-PDLSCs分別與CD3+T細(xì)胞以1∶10、1∶20、1∶50及1∶100比例共培養(yǎng)48h后，進(jìn)行RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄。按照protocol進(jìn)行實(shí)時定量PCR檢測，本課題組的檢測結(jié)果表明：在1∶10-1∶100范圍內(nèi)，隨H/I-PDLSCs與CD3+T細(xì)胞比例的降低，H-PDLSCs組Caspase3及Caspase8 mRNA的表達(dá)水平較對照組顯著降低，且呈逐級下降趨勢（圖2A、B）。而在1∶10-1∶100范圍內(nèi)，隨PDLSCs與CD3+T細(xì)胞比例的降低，I-PDLSCs組Caspase3、Caspase8表達(dá)水平降低與其對照組相比顯著降低，在1∶20、1∶50時，表達(dá)較為穩(wěn)定（圖2C、D），而當(dāng)I-PDLSCs與CD3+T細(xì)胞以1∶100比例共培養(yǎng)后Caspase3及Caspase8基因表達(dá)雖與對照組相比顯著降低但較1∶20、1∶50明顯升高（圖2A、B）。

圖2 CD3+T細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)

A：正常組共培養(yǎng)48h后Real Time PCR檢測Caspase3 mRNA的相對表達(dá)量（*P＜0.05）；B：正常組共培養(yǎng)48h后Real Time PCR檢測Caspase8 mRNA的相對表達(dá)量（*P＜0.05）；C：炎癥組共培養(yǎng)48h后Real Time PCR檢測Caspase3 mRNA的相對表達(dá)量（*P＜0.05，#P＜0.01）；D：炎癥組共培養(yǎng)48h后Real Time PCR檢測Caspase8 mRNA的相對表達(dá)量（*P＜0.05，#P＜0.01）。

2.3 牙周膜干細(xì)胞對CD3+T細(xì)胞IL-6、TNFα基因表達(dá)的影響 我們的研究結(jié)果顯示H-PDLSCs與CD3+T共培養(yǎng)比例為1∶10、1∶20、1∶50及1∶100時隨著濃度的降低其IL-6、TNFα均呈現(xiàn)隨濃度變化而降低的趨勢，在共培養(yǎng)比例為1∶20、1∶50時，表達(dá)較為穩(wěn)定（圖3A、B）。隨PDLSCs與CD3+T細(xì)胞比例的降低，I-PDLSCs組IL-6、TNFα表達(dá)水平顯著降低，1：50比例時IL-6、TNFα降低程度最高，而在共培養(yǎng)比例為1∶100時IL-6、TNFα的基因表達(dá)水平較1∶50有所增高（圖3C、D）。

圖3 CD3+T細(xì)胞炎癥相關(guān)基因表達(dá)

A：正常組共培養(yǎng)48h后Real Time PCR檢測IL-6 mRNA的相對表達(dá)量（*P＜0.05）；B：正常組共培養(yǎng)48h后Real Time PCR檢測TNFαmRNA的相對表達(dá)量（*P＜0.05）；C：炎癥組共培養(yǎng)48h后Real Time PCR檢測IL-6 mRNA的相對表達(dá)量（*P＜0.05，#P＜0.01）；D：炎癥組共培養(yǎng)48h后Real Time PCR檢測TNFαmRNA的相對表達(dá)量（*P＜0.05，#P＜0.01）。

2.4 H-PDLSCs、I-PDLSCs對CD3+T細(xì)胞增殖抑制作用 綜合上述研究結(jié)果，在牙周膜干細(xì)胞與CD3+T細(xì)胞共培養(yǎng)比例為1∶20時其基因檢測較為穩(wěn)定，因此此部分實(shí)驗檢測PDLSCs與CD3+T細(xì)胞在共培養(yǎng)比例1∶20時CD3+T細(xì)胞CCND1 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，H-PDLSCs與CD3+T細(xì)胞共培養(yǎng)組相較對照組CCND-1表達(dá)水平降低（0.27倍，P＜0.05）；I-PDLSCs與CD3+T細(xì)胞共培養(yǎng)組CCND-1相較對照組表達(dá)水平降低（0.48倍，P＜0.05）。而與I-PDLSCs共培養(yǎng)后CD3+T細(xì)胞CCND-1的表達(dá)水平高于與H-PDLSCs組共培養(yǎng)組（圖4）。

圖4 H-PDLSCs/I-PDLSCs與CD3+T細(xì)胞以1∶20比例共培養(yǎng)48h后Real Time PCR檢測CCND1 mRNA的相對表達(dá)量（*P＜0.05）

3.討論

PDLSCs近年來在牙周組織再生領(lǐng)域的研究中，受到了廣泛關(guān)注。其多向分化潛能已經(jīng)得到公認(rèn)。MSCs可以釋放多種細(xì)胞因子，其條件培養(yǎng)基能夠有效增加骨缺損部位的組織愈合，促進(jìn)纖維結(jié)締組織及骨組織增生。與MSCs類似，PDLSCs具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)能力。PDLSCs在維持牙周組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、創(chuàng)傷愈合及組織再生中發(fā)揮重要的作用。有學(xué)者通過對PDLSCs條件培養(yǎng)基及牙周炎動物模型的研究發(fā)現(xiàn)，PDLSCs可以通過降低TNFα的水平，來抑制牙槽骨吸收，促進(jìn)牙周組織再生［13，14］。LI等研究表明PDLSCs可以通過分泌可溶性因子的旁分泌途徑及直接接觸抑制來抑制PHA激活的外周血單核細(xì)胞的增殖，并可以抑制IL-2及IFNγ的分泌［15］。炎癥環(huán)境下，當(dāng)免疫細(xì)胞被活化后，干細(xì)胞分泌的免疫調(diào)節(jié)蛋白增加，從而調(diào)控自身免疫調(diào)節(jié)能力。針對干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)與組織再生的雙重功能本研究設(shè)計相關(guān)實(shí)驗以檢測炎癥條件下PDLSCs對免疫細(xì)胞生物學(xué)性能的影響。

MSCs在機(jī)體微環(huán)境調(diào)控下，可以分泌特定的蛋白質(zhì)，在多種細(xì)胞組織的抗炎和生長愈合中發(fā)揮重要的作用。其可以從多種組織中獲得，除優(yōu)異的分化能力外，其最顯著的特征是免疫調(diào)節(jié)及營養(yǎng)能力［16］。有報道證實(shí)MSCs可以促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生［17］。組織駐留記憶T細(xì)胞（Tissue resident memory T cells，Trm）是一種新的長壽命記憶T細(xì)胞亞群，在先前的細(xì)菌或病毒感染后仍存在于屏障組織中，以支持早期/即時防御機(jī)制，提供針對病原體攻擊的位點(diǎn)特異性保護(hù)。有學(xué)者研究提示，Trm在維持牙周內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要的作用。當(dāng)牙周內(nèi)穩(wěn)態(tài)被打破，牙齦屏障的防護(hù)作用被破壞，細(xì)菌抗原進(jìn)入更深的結(jié)締組織，激活記憶性T細(xì)胞，導(dǎo)致牙周炎的發(fā)生發(fā)展［18，19］。本實(shí)驗采用免疫磁珠法進(jìn)行T細(xì)胞的分離培養(yǎng)，磁珠分選系統(tǒng)分離的細(xì)胞純度可以達(dá)到80-99%，得率在60-90%左右［20］，我們使用了CD3+磁珠從人外周血單個核淋巴細(xì)胞中特異性分離獲取了CD3+T細(xì)胞。

雖然大部分的文獻(xiàn)報道間充質(zhì)干細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗炎作用，但近期也有相關(guān)研究表明在炎癥也能反作用于干細(xì)胞，并提升其免疫調(diào)節(jié)性能。當(dāng)使用外源性炎癥因子TNF-α及INF-γ刺激MSCs后其分泌的iNOS水平增高，從而使其對T淋巴細(xì)胞的增殖抑制能力增強(qiáng)，能夠更好的發(fā)揮免疫抑制作用［21］。INF-γ聯(lián)合Toll受體激動劑能共同介導(dǎo)PDLSCs產(chǎn)生IDO-1，從而增強(qiáng)PDLSCs在牙周炎疾病條件下的免疫應(yīng)答。T淋巴細(xì)胞在人體細(xì)胞免疫中起著重要作用，研究證實(shí)PDLSCs不引起同種異體T淋巴細(xì)胞的增殖，卻能抑制絲裂原和混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)引起的T淋巴細(xì)胞增殖，其主要是由可溶性因子在PDLSCs介導(dǎo)的免疫抑制中發(fā)揮了主導(dǎo)作用［22］。Caspase-8在Caspases家族中舉足輕重，作為介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要蛋白，可以在外界因素刺激下，啟動級聯(lián)反應(yīng)，從而激活Caspase-3，釋放DNA降解酶，降解DNA，最終使細(xì)胞發(fā)生凋亡［23］。TNFα作為牙周炎發(fā)生發(fā)展中經(jīng)典的炎癥因子，在活動性牙周炎的牙周組織中呈高表達(dá)水平，在牙周膠原破壞以及骨質(zhì)吸收中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。IL-6具有多種生物學(xué)活性，可以借助內(nèi)分泌途徑發(fā)揮全身功效，其中就包括強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)及抗感染功能。本實(shí)驗結(jié)果表明，正常組PDLSCs與CD3+T細(xì)胞共培養(yǎng)時，在PDLSCs與CD3+T細(xì)胞比例1∶10至1∶100范圍內(nèi)，隨著PDLSCs比例的降低，前者對后者的抑制作用增加，抑制了凋亡基因Caspase3/8、炎癥因子IL-6、TNFα的mRNA表達(dá)水平。在二者比例為1∶50時，抑制作用較為穩(wěn)定。炎癥因子組PDLSCs與CD3+T細(xì)胞共培養(yǎng)時，在PDLSCs與CD3+T細(xì)胞比例1∶10至1∶100范圍內(nèi)，隨著PDLSCs比例的降低，前者對后者凋亡及炎癥因子分泌的抑制作用增加，抑制了凋亡基因Caspase3/8、炎癥因子IL-6、TNFα的mRNA表達(dá)水平。說明PDLSCs可以保護(hù)淋巴細(xì)胞數(shù)目的減少。在二者比例為1∶20及1∶50時，作用較為穩(wěn)定。這與Najar M等的研究結(jié)果相似，從各種來源中（骨髓、脂肪組織等）分離的MSCs以劑量依賴方式抑制CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞亞群［24］。H-PDLSCs在與CD3+T細(xì)胞按照1∶10、1∶20、1∶50及1∶100的比例共培養(yǎng)后CD3+T細(xì)胞的Caspase3、Caspase8、IL-6、TNF-α的表達(dá)呈逐步下降趨勢，說明正常情況下H-PDLSCs的免疫調(diào)節(jié)方面的能力呈穩(wěn)定趨勢。而在I-PDLSCs在與CD3+T細(xì)胞按照1∶10、1∶20、1∶50及1∶100的比例共培養(yǎng)后CD3+T細(xì)胞的Caspase3、Caspase8、IL-6、TNF-α的表達(dá)在1∶10、1∶20、1∶50時呈逐步降低趨勢，而在1∶100時出現(xiàn)反彈式增高趨勢，呈現(xiàn)這種不穩(wěn)定的趨勢的原因可能是由于在本實(shí)驗的檢測期間CD3+T Caspase3、Caspase8表達(dá)水平增高致使細(xì)胞呈現(xiàn)顯著凋亡趨勢，而鑒于CD3+T的免疫執(zhí)行能力進(jìn)而反饋性的轉(zhuǎn)錄合成大量IL-6、TNF-α。另一方面，慢性炎癥導(dǎo)致的干細(xì)胞生物學(xué)功能的變化機(jī)理較為復(fù)雜，炎癥刺激可導(dǎo)致干細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵蛋白的自分泌及旁分泌功能發(fā)生變化，這些蛋白可影響干細(xì)胞的自噬、凋亡、增殖、分化等功能，本研究的結(jié)果在而在I-PDLSCs在與CD3+T細(xì)胞按照1∶100時出現(xiàn)反彈式增高趨勢這與上述因素有一定的關(guān)系，其具體分子生物學(xué)機(jī)制尚待深入研究。

此外，我們的研究還證實(shí)無論正常還是炎癥條件下的牙周膜干細(xì)胞對CD3+T細(xì)胞均有一定的增殖抑制能力。CCND1在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要的作用。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合后被激活，促進(jìn)細(xì)胞周期G1、S、G2、M的定向轉(zhuǎn)變。本實(shí)驗數(shù)據(jù)表明，在共培養(yǎng)后，與H-PDLSCs組共培養(yǎng)的CD3+T細(xì)胞CCND1基因的表達(dá)水平是與I-PDLSCs共培養(yǎng)的0.5倍，說明I-PDLSCs對CD3+T細(xì)胞增殖的抑制作用減弱。提示在炎癥狀態(tài)下PDLSCs的免疫調(diào)節(jié)能力下降。我們證實(shí)了正常及炎癥因子組PDLSCs均可呈濃度依賴性抑制CD3+T細(xì)胞的增殖及炎癥因子分泌。但是具體的機(jī)制尚不清楚，仍待我們進(jìn)一步探究。