許向華 夏初 黃怡

侵襲性曲霉病是一種嚴重的真菌病，煙曲霉是最常見的病原體，肺部是最常見的感染部位[1-2]。侵襲性曲霉病常由多種因素誘發(fā)，造血干細胞移植、惡性血液病和粒細胞缺乏是其主要高危因素[3]，近年來研究發(fā)現，無高危因素的侵襲性曲霉病逐漸增多[4]。2010年Gangneux等[5]報道30%～50%的侵襲性曲霉病發(fā)生于非粒細胞缺乏患者；2019年Chakrabarti等[2]發(fā)現超過60%的侵襲性曲霉病患者無高危因素，且預后不良，死亡率超過70%；表明非高危因素在侵襲性曲霉病中的作用也應受到重視。糖尿病是侵襲性曲霉病的非高危因素之一，高達28.9%～30.9%的侵襲性曲霉病患者患有糖尿病[1-2]，其機制尚不清楚。中性粒細胞胞外誘捕網(NETs)是由中性粒細胞釋放的覆蓋著組蛋白和抗菌蛋白的DNA網狀結構，中性粒細胞通過一個稱為NETosis的過程來釋放NETs。NETs既是中性粒細胞的一種殺菌工具，也是一種炎癥介質，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關[6]。煙曲霉感染時糖尿病患者中性粒細胞釋放NETs情況及其作用目前尚不清楚，推測可能存在NETs釋放異常，且這種異常可能與糖尿病患者對侵襲性曲霉病的易感性增加有關。因此，我們建立了2型糖尿病(T2DM)和侵襲性曲霉病小鼠模型，比較發(fā)生侵襲性曲霉病時糖尿病小鼠和無糖尿病對照小鼠的易感性和中性粒細胞釋放NETs的情況，旨在探討NETs在糖尿病患者發(fā)生侵襲性曲霉病時所起的作用，以期在糖尿病患者中預防侵襲性曲霉病的發(fā)生或改善侵襲性曲霉病的治療效果。

材料與方法

1.材料

(1)動物：5周齡雄性C57BL/6小鼠，體質量為(18±2)g，購自斯萊克實驗動物有限責任公司(上海)，按照《實驗動物的管理和使用指南(第八版)》[7]的標準飼養(yǎng)管理動物，在暴露前適應7天。采用隨機數字法將48只小鼠分為糖尿病組和對照組，每組各24只。其中，真菌負荷實驗中兩組各處死15只；炎癥因子檢測時兩組各處死3只；肺組織病理和NETs檢測時兩組各處死3只；中性粒細胞分離實驗中兩組各處死3只。

(2)煙曲霉菌株：表達綠色熒光蛋白的煙曲霉菌株(ATCC13703)由美國科羅拉多大學健康科學中心Nancy Madinger博士贈送。

(3)其他材料：高脂(提供60%的能量)飼料和低脂(提供10%的能量)飼料購自Research Diets公司(美國)，鏈脲佐菌素(STZ)購自Sigma-Aldrich公司(美國)，RPMI 1640培養(yǎng)基購自Gibco公司(美國)，Sabouraud培養(yǎng)基、Sabouraud液體培養(yǎng)基和Tween-80購自Sigma-Aldrich公司(美國)，小鼠外周血中性粒細胞分離液試劑盒購自Miltenyi Biotec公司(德國)，小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細胞介素1β(IL-1β)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自R&D公司(美國)，Anti-Ly6G抗體[RB6-8C5]異硫氰酸熒光素(FITC)和組蛋白3(H3)一抗Anti-Histone H3抗體購自Abcam公司(英國)，H3二抗DyLight549 goat anti-rabbit IgG[H+L]購自聯科生物(中國)，二脒基苯基吲哚(DAPI)、二甲氧唑黃(XTT)和吩嗪硫酸甲酯(PMS)購自Sigma-Aldrich公司(美國)，Triton X-100購自生工公司(中國)。本研究經我院倫理委員會審批通過。

2.方法

(1)T2DM小鼠模型建立：參考文獻[8]，用高脂飼料飼養(yǎng)糖尿病組小鼠4周后，每天腹腔注射40 mg/kg體重的STZ，連續(xù)5天。STZ注射結束1周后，測定非空腹血糖≥250 mg/dl診斷為糖尿病[9]。對照組小鼠喂食低脂飼料，以相同劑量的檸檬酸鈉緩沖液代替STZ注射。兩組在注射完成2周后進行煙曲霉感染。

(2)煙曲霉感染：煙曲霉孢子懸液的制備參考文獻[10]并略加修改：孢子接種于Sabouraud培養(yǎng)基上培養(yǎng)，當菌苔鋪滿培養(yǎng)基時，用含0.1% Tween-80的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，過濾去除菌絲，孢子重懸在PBS中，調整孢子懸液濃度為5×107/ml備用。菌絲懸液制備參考文獻[11]并略加修改：在Sabouraud液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)煙曲霉孢子(1×106cfu/ml)16～24小時，收集菌絲，PBS沖洗后用超聲破碎法將菌絲打碎成10～100 μm碎片，配制的菌絲碎片濃度為1×106cfu/ml。采用滴鼻法感染煙曲霉孢子，參照文獻[12]并加以修改：將小鼠用乙醚麻醉后保持直立狀，用移液器吸取20 μl濃度為5×107/ml的煙曲霉孢子懸液，從鼻孔慢慢滴入。孢子懸液滴入2小時后，參照文獻[11]的方法，通過口咽灌注法注入菌絲懸液，每只小鼠1×104cfu。

(3)組織學檢查：參考文獻[12]的方法解剖和固定小鼠肺組織，固定好的肺組織用石蠟包埋，組織切片，采用蘇木素-伊紅(HE)染色評估炎癥反應。

(4)中性粒細胞分離和培養(yǎng)：采用心腔內穿刺法采集循環(huán)血[13]。以小鼠外周血中性粒細胞分離液試劑盒純化中性粒細胞。用RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細胞，于37 ℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

(5)真菌負荷檢測：無菌條件下取小鼠右肺上、中、下固定位置的組織20 mg，加入200 μl生理鹽水研磨破碎，制成10倍稀釋系列1×10、1×102和1×103稀釋度懸液，從各稀釋度懸液分別取100 μl接種于Sabouraud培養(yǎng)基上，每濃度3塊平皿，置于霉菌培養(yǎng)箱中26.5 ℃培養(yǎng)7天。根據培養(yǎng)基上菌落數計算懸液中曲霉菌落數：菌落數/ml=(各稀釋度3個平皿中菌落平均數×稀釋倍數之和)/3。

(6)細胞因子檢測：使用小鼠ELISA試劑盒測量組織裂解液中的TNF-α和IL-1β含量，按照說明書進行操作。

(7)NETs檢測：采用免疫熒光染色激光共聚焦顯微鏡檢測NETs。Anti-Ly6G抗體用于標記粒細胞；H3一抗和二抗用于標記H3；DAPI用于DNA染色。細胞外H3和DAPI共定位代表NETs，根據細胞外H3的陽性率比較NETs含量。NETs的檢測參照文獻[11]并略加修改。肺組織NETs檢測方法：標本脫蠟，水化，抗原修復；封閉1小時；孵育Ly6G抗體和H3一抗，4 ℃過夜；孵育H3二抗2小時；DAPI染色；封片劑封片。中性粒細胞NETs檢測：在滅菌的12孔板中鋪上爬片，新鮮分離的中性粒細胞接種于爬片上(1×104個細胞/孔，每組3個孔)，孵育1小時后加入菌絲(中性粒細胞與菌絲比例為10 ∶1)，置于5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)6小時；PBS漂洗；4%多聚甲醛和0.5%Triton X-100處理；孵育Ly6G抗體和H3一抗，4 ℃過夜；孵育H3二抗2小時；DAPI染色；封片劑封片。激光共聚焦顯微鏡(Leica)下檢查分析拍照。采用ImageJ軟件進行圖片灰度掃描，得出Ly6G及H3的陽性率。

(8)菌絲活力檢測：參照文獻[14]并略加修改，采用XTT還原法檢測煙曲霉菌絲活力。菌絲和中性粒細胞共孵育于96孔板中。終止孵育前用H2O/NaOH(pH 11.0)裂解中性粒細胞。隨后用20 μl的XTT/PMS孵育菌絲2小時。吸取上清液，用酶標儀(Thermo,中國)在450 nm處測光密度(OD)值。

結 果

1.兩組小鼠真菌負荷比較：在煙曲霉感染后24小時、72小時、120小時，兩組分別處死5只小鼠，檢測肺組織真菌負荷，結果顯示，對照組在感染后24小時[(1 722±184) cfu]、72小時[(2 814±269) cfu]呈高負荷狀態(tài)，至120小時[(1 232±301)cfu]顯著降低；糖尿病組小鼠在感染后真菌負荷逐漸增高，持續(xù)保持在高負荷狀態(tài)[24小時：(1 770±161) cfu，72小時：(4 248±677) cfu；120小時：(5 089±710) cfu]，72小時和120小時時均明顯高于對照組同一時間(P<0.01)。在感染后第5天熒光顯微鏡下觀察結果示，糖尿病組小鼠肺組織可見菌絲，而對照組小鼠罕見，見圖1。

圖1 兩組小鼠感染煙曲霉后第5天肺組織熒光顯微鏡下觀察結果：糖尿病組小鼠肺組織仍可見表達綠色熒光蛋白的菌絲(如箭頭所示)，而對照組小鼠罕見(A:對照組，B：糖尿病組；×200) 圖2 兩組小鼠感染后48小時肺組織病理檢查結果(A:對照組，B：糖尿病組；HE染色，×200)

2.兩組小鼠炎癥病變程度比較：煙曲霉感染后24小時，糖尿病組小鼠IL-1β水平明顯高于對照組[(52.32±5.94)pg/ml比(29.28±5.95)pg/ml，P<0.05]，TNF-α水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義[(130.37±12.91)pg/ml比(109.71±18.81)pg/ml，P>0.05]。感染后48小時，兩組小鼠肺組織病理檢查結果顯示，對照組小鼠病變區(qū)域肺組織結構完整，肺泡間隔水腫增寬，有較多中性粒細胞和其他炎癥細胞浸潤；糖尿病小鼠病變區(qū)域有大量的中性粒細胞和其他炎癥細胞浸潤，肺泡間隔明顯水腫增寬，肺泡腔明顯縮小，見圖2。

3.兩組小鼠肺組織NETs比較：煙曲霉感染后48小時，肺組織經免疫熒光染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察,可見糖尿病組小鼠肺組織中NETs更多，見圖3。糖尿病組和對照組小鼠肺組織中Ly6G陽性率比較差異無統(tǒng)計學意義[(18.93±3.71)%比(12.55±3.13)%，P>0.05);糖尿病組小鼠肺組織中H3陽性率明顯高于對照組[(15.73±1.70)%比(9.97±1.33)%，P<0.05)。

圖3 兩組小鼠肺組織NETs比較：紅色：H3，綠色：Ly6G，藍色：DAPI染色的DNA，Merge1：Ly6G、H3、DAPI疊加，Merge2：H3、DAPI疊加(免疫熒光染色，×200)；細胞外H3和DAPI共定位代表NETs

4.兩組小鼠中性粒細胞釋放NETs能力及殺菌能力比較：糖尿病小鼠中性粒細胞H3的陽性率明顯高于對照小鼠[(19.57±3.10)%比(10.60±1.15)%，P<0.05]。在加入菌絲前加入NADPH氧化酶抑制劑氯化二亞苯基碘(DPI，10 μmol/L)重復上述實驗，鏡下見兩組小鼠中性粒細胞釋放的NETs均明顯減少(圖4)，兩組小鼠中性粒細胞H3陽性率均下降，糖尿病小鼠H3陽性率與對照組小鼠比較差異無統(tǒng)計學意義[(8.30±0.85)%比(8.03±0.65)%，P>0.05]。共孵育24小時后進行菌絲活力檢測結果顯示，糖尿病組的菌絲活力明顯高于對照組(0.82±0.04比0.65±0.05，P<0.05)。

圖4 兩組小鼠中性粒細胞釋放的NETs和菌絲活力比較：紅色：H3；綠色：Ly6G；藍色：DAPI染色DNA；Merge：Ly6G、H3、DAPI疊加；細胞外H3和DAPI共定位代表NETs；DPI(-)表示不加DPI，DPI(+)表示加入DPI；對照組和糖尿病組箭頭指向細胞外的NETs(免疫熒光染色，×400)

討 論

非嚴重免疫缺陷的侵襲性曲霉病動物模型的制作目前存在困難，研究發(fā)現非嚴重免疫缺陷小鼠會很快清除經氣道感染的曲霉孢子，難以誘導侵襲性曲霉病[12,15]。Rohm等[11]發(fā)現給免疫功能正常的小鼠感染菌絲可以模擬侵襲性肺曲霉病。然而這種單純菌絲感染并不符合自然感染的過程，因此，我們先按照自然感染的方式予小鼠感染孢子，再感染菌絲以模擬侵襲性病變。我們發(fā)現，上述方法能較好地模擬侵襲性曲霉病。對照組小鼠感染后，能迅速將病原體清除；而糖尿病小鼠感染后，在觀察期內肺部真菌負荷持續(xù)增加，表明糖尿病小鼠對煙曲霉的易感性高于對照組。

糖尿病患者中性粒細胞NETosis調節(jié)失衡，在非感染情況下NETs被過度釋放[16]，但在感染情況下NETs的變化比較復雜。Joshi等[17]發(fā)現在高糖環(huán)境下用脂多糖刺激中性粒細胞時NETs形成受損；Lee等[18]發(fā)現在肺炎克雷伯桿菌感染時糖尿病患者與非糖尿病患者中性粒細胞NETs形成相當；Cohen等[19]發(fā)現糖尿病小鼠在金黃色葡萄球菌感染時中性粒細胞釋放NETs增多。以上結果均表明，糖尿病患者感染時NETs的改變可能與病原體種類或宿主免疫狀態(tài)等因素有關。

關于NETs在曲霉感染中的作用，之前已有多項研究進行報道。Bianchi等[20]發(fā)現通過基因治療恢復NETs能夠有效控制慢性肉芽腫病患者的曲霉?。籑cCormick等[21]發(fā)現NETs能抑制煙曲霉生長；Bruns等[22]發(fā)現NETs對煙曲霉具有中等程度的殺傷。然而，也有研究得出不同甚至相反的結論，如Gazendam等[14]報道NETs對曲霉沒有殺傷作用；Alflen等[23]報道NETs可阻止機體對曲霉的清除。這些研究結論的不同可能受實驗條件影響，也可能表明NETs在曲霉感染中的作用比較復雜，還未被真正揭示。本研究發(fā)現，經煙曲霉感染后，糖尿病組小鼠中性粒細胞釋放的NETs多于對照組小鼠，對煙曲霉菌絲的殺傷作用弱于對照組小鼠。由于中性粒細胞不能吞噬菌絲這樣的大型微生物，其對菌絲的殺傷作用主要是依靠釋放到細胞外的物質進行，因此本研究表明NETs對菌絲的殺傷能力很弱或沒有殺傷作用，推測過多的NETs可能與更嚴重的肺部損傷相關。

NETs形成包括NADPH氧化酶依賴和非依賴兩種方式[24]。我們發(fā)現，在小鼠肺曲霉感染時，NETs形成與NADPH氧化酶激活有關，NADPH氧化酶抑制劑DPI可以顯著降低NETs釋放，這種作用對糖尿病小鼠中性粒細胞更加顯著，表明糖尿病小鼠中性粒細胞NETs過度釋放與NADPH氧化酶異常激活有關。

綜上所述，糖尿病小鼠中性粒細胞過度釋放的NETs沒有增強中性粒細胞對煙曲霉菌絲的殺傷，而且可能加重組織損傷。通過調節(jié)NADPH氧化酶來抑制過多的NETs形成可能對糖尿病患者預防或治療曲霉感染有益。