蘭超，曹雷，劉娜

保定市第一醫(yī)院1呼吸內(nèi)科，3感染性疾病科，河北 保定 071000 2保定市第一中心醫(yī)院影像科，河北 保定 071000

肺癌是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，具有較高的致死率。根據(jù)不同的病理類型可將肺癌分為小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非 小 細(xì) 胞 肺 癌（non- small cell lung cancer，NSCLC），其中NSCLC 占所有肺癌類型的80%以上。多數(shù)肺癌患者在確診時(shí)已是肺癌晚期，具有較差的預(yù)后。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，生物標(biāo)志物的檢測(cè)能夠?yàn)榉伟┑念A(yù)后提供有效的評(píng)估。miRNA 的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、遷移等過程有關(guān)，影響包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生與預(yù)后。miRNA-1296 與包括NSCLC 在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生及預(yù)后有關(guān)。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是一種酪氨酸特異性蛋白激酶受體，同時(shí)在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中有重要的作用，與細(xì)胞的增殖、侵襲及腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)。趙敏等研究表明，EGFR 在NSCLC 患者血清中的表達(dá)水平高于健康組，是治療NSCLC 的主要靶點(diǎn)。胃癌細(xì)胞中經(jīng)熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證EGFR 是miRNA-1296-5p 的靶點(diǎn)。本研究通過檢測(cè)NSCLC 患者血清miRNA-1296、EGFR 的表達(dá)水平，分析二者之間的關(guān)系及與患者預(yù)后的相關(guān)性，探討二者血清檢測(cè)對(duì)NSCLC 預(yù)后的評(píng)估價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015 年2 月至2017 年9 月于保定市第一醫(yī)院確診的NSCLC 患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診為NSCLC；②術(shù)前未進(jìn)行放化療或手術(shù)治療；③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①肝、腎等重大器官功能不全；②合并其他腫瘤疾??；③自身患有免疫性疾病。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入61 例NSCLC 患者為NSCLC 組，其中男37 例，女24例；年齡39～78 歲，平均（60.29±9.65）歲；有吸煙史44 例；鱗狀細(xì)胞癌26 例，腺癌30 例，其他肺癌5 例；根據(jù)《國際肺癌研究協(xié)會(huì)第八版肺癌TNM 分期》進(jìn)行臨床分期：Ⅰ期15 例，Ⅱ期31 例，Ⅲ期15 例；根據(jù)《2015 版世界衛(wèi)生組織肺癌組織學(xué)分類》進(jìn)行組織學(xué)分化程度分級(jí)：低分化13 例，中分化34例，高分化14 例。另選取同期健康體檢者61 例為對(duì)照組，男35 例，女26 例；年齡38～79 歲，平均（58.63±10.17）歲；有吸煙史41 例。兩組研究對(duì)象年齡、性別、吸煙史比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹥0.05），具有可比性。

1.2 主要試劑及儀器

RNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒均購自日本Takara 公司，酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELΙSA）EGFR 試劑盒購自美國R&D 公司；引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司；qRTPCR 儀CFX96 購自美國BΙO-RAD 公司，Nanodrop one 2000 分光光度計(jì)購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 血液樣品采集 NSCLC 患者于住院次日清晨、對(duì)照組于體檢當(dāng)日清晨，抽取空腹血3 ml 至離心管中，4 ℃，3000 r/min 離心15 min，之后轉(zhuǎn)移上清至新離心管中，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.3.2 qRT-PCR 檢測(cè) 血清miRNA-1296 的水平利用RNA 提取試劑盒對(duì)所有受試者血清RNA 進(jìn)行提取，對(duì)所提取RNA 濃度進(jìn)行測(cè)定，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，之后qRT-PCR 檢測(cè)血清miRNA-1296 水平，循環(huán)條件為：95 ℃60 s；95 ℃30 s，58 ℃45 s，72 ℃30 s，共40 個(gè)循環(huán)。以

U6

為內(nèi)參，采用2法計(jì)算血清miRNA-1296 相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。miRNA-1296 正向引物序列：5'-TTGTTAGGGCCCTGGCTC-3'，反向引物序列：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。

U6

正向引物序列：5'-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3'，反向引物序列：5'-CAGGGGCCATGCTAATCTT-3'。

1.3.3 ELISA 試劑盒檢測(cè) EGFR 的水平采用ELΙSA 雙抗體夾心法對(duì)兩組受試者血清EGFR 水平進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

1.3.4 隨訪 通過電話或門診復(fù)查的方式對(duì)NSCLC 患者進(jìn)行隨訪，記錄患者生存狀態(tài)，隨訪截止日期為2020 年5 月31 日。根據(jù)NSCLC 組患者隨訪期間是否死亡，將患者分為死亡組27 例，生存組34 例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 血清miRNA-1296、EGFR 水平的比較

NSCLC 組患者血清miRNA-1296 水平明顯低于對(duì)照組，而EGFR 水平明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹤0.01）。（表1）

表1 兩組受試者血清miRNA-1296、EGFR水平的比較（±s）

2.2 不同預(yù)后NSCLC 患者血清miRNA-1296、EGFR 水平的比較

死亡組NSCLC 患者血清miRNA-1296 水平明顯低于生存組，而EGFR 水平明顯高于生存組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹤0.01）。（表2）

表2 不同預(yù)后NSCLC 患者血清miRNA-1296、EGFR 水平的比較（x-±s）

2.3 血清miRNA-1296、EGFR 水平對(duì)NSCLC 預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

ROC 曲線分析結(jié)果顯示，血清miRNA-1296 與EGFR 聯(lián)合預(yù)測(cè)NSCLC 患者預(yù)后的AUC、靈敏度、特異度均高于二者單獨(dú)預(yù)測(cè)結(jié)果。（表3、圖1）

圖1 血清miRNA-1296和EGFR單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)NSCLC預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值的ROC曲線

表3 血清miRNA-1296、EGFR 水平對(duì)NSCLC 預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

2.4 miRNA-1296 與EGFR 的相關(guān)性分析

NSCLC 患者血清miRNA-1296、EGFR 水平呈負(fù)相關(guān)（

r

=-0.496，

P

﹤0.05）。

2.5 miRNA-1296、EGFR與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系

ROC 曲線分析結(jié)果顯示，EGFR、miRNA-1296截?cái)嘀捣謩e為5.96 ng/ml、0.48，根據(jù)兩者截?cái)嘀担瑢SCLC 患者分為miRNA-1296 高表達(dá)組（miRNA-1296 ﹥0.48，

n

=29）、miRNA-1296 低 表 達(dá) 組（miRNA-1296≤0.48，

n

=32），EGFR 高表達(dá)組（EGFR﹥5.96 ng/ml，

n

=28）、EGFR 低表達(dá)組（EGFR≤5.96 ng/ml，

n

=33）。隨訪期內(nèi)，miRNA-1296 高表達(dá)組患者累積生存率為75.86%，明顯高于低表達(dá)組的37.50% ，差 異 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義（

χ

=9.764，

P

=0.002）；EGFR 高表達(dá)組患者累積生存率為28.57%，明顯低于低表達(dá)組的78.79%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=18.942，

P

=0.000）。（圖2、圖3）

圖2 血清miRNA-1296低表達(dá)組（n=32）與高表達(dá)組（n=29）NSCLC患者的生存曲線

圖3 血清EGFR低表達(dá)組（n=33）與高表達(dá)組（n=28）NSCLC患者的生存曲線

2.6 NSCLC 預(yù)后影響因素的Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析

單因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析表明，年齡、吸煙史、組織類型、TNM 分期、分化程度及血清miRNA-1296、EGFR 水平均可能是NSCLC 患者預(yù)后的影響因素。多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析表明，血清EGFR 水平高表達(dá)是NSCLC 患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（

P

﹤0.05），血清miRNA-1296 水平高表達(dá)是NSCLC 患者預(yù)后的保護(hù)因素（

P

﹤0.05）。（表4）

表4 NSCLC 預(yù)后影響因素的Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析

3 討論

NSCLC 主要包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和大細(xì)胞癌等，其發(fā)生可能與吸煙、空氣污染、遺傳有關(guān)。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，肺癌在診斷、手術(shù)及靶向治療方面均取得了一定的進(jìn)步，但肺癌的預(yù)后并沒有太大的改善，生存率仍較低。本研究對(duì)61 例NSCLC 患者進(jìn)行隨訪，期間共有27 例患者死亡，病死率高達(dá)44.26%，說明肺癌患者具有較差的預(yù)后。因此，尋找NSCLC 有效的治療靶點(diǎn)和生物預(yù)測(cè)標(biāo)志物具有十分重要的意義。

miRNA-1296 是一種與惡性腫瘤有關(guān)的新型miRNA，其表達(dá)失調(diào)影響多種腫瘤發(fā)生及預(yù)后。Zhang 等研究表明，miRNA-1296 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中明顯下調(diào)，且miRNA-1296 低表達(dá)與患者的5 年總生存期有關(guān)。Xu 等研究表明，與癌旁組織及健康細(xì)胞系比較，miRNA-1296 在肝癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)降低，且與肝癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)有關(guān)，可能是肝癌預(yù)后的生物標(biāo)志物。Deng 等研究表明，NSCLC 組織和細(xì)胞中miRNA-1296 表達(dá)明顯下調(diào)，且miRNA-1296的低表達(dá)是NSCLC預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，并且miRNA-1296能夠通過WNT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制NSCLC細(xì)胞的增殖、侵襲。本研究結(jié)果表明，NSCLC 患者血清miRNA-1296 表達(dá)明顯低于對(duì)照組（

P

﹤0.01），且死亡組miRNA-1296 表達(dá)明顯低于生存組（

P

﹤0.01），說明miRNA-1296 可能與NSCLC 的發(fā)生和預(yù)后有關(guān)。季昳弛等研究表明，血清miRNA-1296 表達(dá)對(duì)甲狀腺乳頭狀癌具有一定的診斷價(jià)值。本研究ROC 曲線分析結(jié)果表明，miRNA-1296 對(duì)預(yù)測(cè)NSCLC 患者預(yù)后具有較高的靈敏度和特異度，截?cái)嘀禐?.48，提示當(dāng)患者血清miRNA-1296 表達(dá)低于0.48 時(shí)，需注意患者日常護(hù)理與復(fù)查，從而避免患者病情惡化導(dǎo)致死亡。根據(jù)截?cái)嘀祵SCLC 患者分為miRNA-1296 高表達(dá)組與miRNA-1296 低表達(dá)組，Kaplan-Meier 生存曲線分析結(jié)果表明，miRNA-1296 高表達(dá)組NSCLC 患者生存率高于miRNA-1296 低表達(dá)組，多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析表明，血清miRNA-1296 水平高表達(dá)是NSCLC 患者預(yù)后的保護(hù)因素（

P

﹤0.05），提示miRNA-1296 水平可能與NSCLC 患者預(yù)后有關(guān)，可能是NSCLC 患者預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

EGFR

基因位于人類7 號(hào)染色體p13-q22 區(qū)，是一種分布于上皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等細(xì)胞膜外表的多功能糖蛋白，其主要有1186 個(gè)氨基酸殘基，是細(xì)胞增殖和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體。EGFR 參與代謝、生長和凋亡等多種生理和病理過程，研究表明EGFR 在乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等腫瘤組織中過度表達(dá)，同時(shí)EGFR 也參與肺癌的發(fā)病機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC 患者血清EGFR 水平明顯高于對(duì)照組（

P

﹤0.01），死亡組患者血清EGFR水平明顯高于生存組（

P

﹤0.01），提示血清EGFR表達(dá)可能與NSCLC 的發(fā)生和預(yù)后有關(guān)。唐微等研究認(rèn)為EGFR陽性表達(dá)與肺腺癌分化程度、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能與患者預(yù)后關(guān)系密切。本研究ROC曲線分析結(jié)果表明，血清EGFR水平對(duì)NSCLC預(yù)后具有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值，截?cái)嘀禐?.96 ng/ml，提示當(dāng)NSCLC患者血清EGFR水平高于5.96 ng/ml時(shí)需關(guān)注患者預(yù)后。根據(jù)所得截?cái)嘀祵SCLC 患者分為EGFR 高表達(dá)組和低表達(dá)組，隨訪期間EGFR高表達(dá)組患者生存率低于低表達(dá)組，多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析表明，血清EGFR 水平高表達(dá)是NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示EGFR可能與NSCLC 患者預(yù)后有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。Jia等研究表明，miRNA-1296通過靶向EGFR 抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，從而影響胃癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果表明，NSCLC 患者血清miRNA-1296 水平與EGFR 呈負(fù)相關(guān)，猜測(cè)miRNA-1296 可能通過調(diào)控EGFR 的表達(dá)進(jìn)而影響NSCLC 的發(fā)生和預(yù)后，而相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究還發(fā)現(xiàn)miRNA-1296 聯(lián)合EGFR 預(yù)測(cè)NSCLC 患者預(yù)后靈敏度和特異度高于二者單獨(dú)預(yù)測(cè)，提示miRNA-1296 與EGFR 均可能是NSCLC 患者預(yù)后的潛在預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

綜上所述，NSCLC 患者血清miRNA-1296、EGFR 水平與患者的預(yù)后有關(guān)，二者聯(lián)合檢測(cè)可能對(duì)患者預(yù)后進(jìn)行更有效的評(píng)估，從而使患者獲得針對(duì)性的治療。在NSCLC 患者中miRNA-1296 與EGFR 呈負(fù)相關(guān)，二者可能協(xié)同參與NSCLC 的發(fā)生和預(yù)后，可能是NSCLC 的潛在治療靶點(diǎn)。然而，本研究?jī)H對(duì)患者血清miRNA-1296、EGFR 水平進(jìn)行檢測(cè)，二者在NSCLC 中具體作用通路還需進(jìn)一步研究。