王婧雯，李昌澤，徐瑋臻，華葉婧，王桐桐，谷婉瑩，鄭薈，隋宏書*

(1.山東第一醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271000；2.山東第一醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，山東 泰安 271000)

0 引言

脊髓缺血后再灌注損傷(Spinal Cord Ischemia Injury，SCII)的病理過程是脊髓修復(fù)和功能重建的瓶頸，由于目前尚無有效治療手段，常導(dǎo)致不可逆性肢體功能障礙，影響患者的身心健康。引起脊髓缺血再灌注損傷的病理因素是復(fù)雜的，脂質(zhì)過氧化、鈣離子蓄積、細(xì)胞凋亡以及炎癥反應(yīng)等因素均可導(dǎo)致SCII的發(fā)生[1]。薯蕷皂苷元(diosgenin)是一種從茄屬植物和薯蕷屬植物中獲得天然留體皂苷配基，具有抗氧自由基、對(duì)抗鈣超載和抑制細(xì)胞凋亡的作用[2]，目前臨床多利用其抗炎作用生產(chǎn)甾體激素類藥物如氫化可的松、地塞米松等[3]。但是，關(guān)于薯蕷皂苷元在大鼠的脊髓缺血再灌注損傷模型中的保護(hù)作用尚未見報(bào)道。鑒于此，本項(xiàng)目擬通過手術(shù)建立大鼠SCII模型，探究薯蕷皂苷元對(duì)脊髓組織氧化損傷的保護(hù)程度。同時(shí)通過分子生物學(xué)等技術(shù)探究該保護(hù)作用的具體分子機(jī)制，為臨床上治療SCII提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品與儀器

丙二醛檢測(cè)試劑盒購自深圳子科生物科技有限公司，超氧化物歧化酶的檢測(cè)試劑盒購自上海瑞番生物研究所，薯蕷皂苷元購自成都化夏化學(xué)試劑有限公司。UV1000紫外/可見分光光度計(jì)(濟(jì)南千司生物有限公司)；恒溫水浴鍋(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

30只5 周齡雄性SD大鼠(250～280g)，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育及生物技術(shù)研究所。動(dòng)物房通過控光實(shí)現(xiàn)12h光照-黑暗循環(huán)，保持良好通風(fēng)及適宜室溫(23～26℃)。本實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物的飼養(yǎng)程序均符合國家《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》的各項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)和山東第一醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物管理委員會(huì)倫理指南。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠SCII模型的建立

30只5 周齡雄性SD大鼠隨機(jī)分為三組：假手術(shù)組、SCII組、干預(yù)組。采用10%水合氯醛，2mL/kg進(jìn)行腹腔注射，將大鼠側(cè)臥固定，備皮后使用75%酒精消毒，在大鼠左側(cè)肋弓下緣中線做切口，沿左腎和左腎動(dòng)脈尋找腹主動(dòng)脈，假手術(shù)組只暴露并游離腹主動(dòng)脈，SCII 組及干預(yù)組于腎動(dòng)脈以下用動(dòng)脈夾持續(xù)夾閉45min。完全阻斷腹主動(dòng)脈血流的標(biāo)志是感受不到股動(dòng)脈搏動(dòng)及大鼠雙后肢出現(xiàn)發(fā)紺冰涼現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)中需使用烤燈維持大鼠體溫，并用生理鹽水濕敷?？p合創(chuàng)口后肌注青霉素以預(yù)防感染。

1.3.2 給藥及取材方法

大鼠SCII模型建立30min后，干預(yù)組予以100mg/kg薯蕷皂苷元灌胃，假手術(shù)組和SCII組腹腔灌胃等體積0.9%的生理鹽水。于血液再灌注24h后觀察清醒大鼠的后肢運(yùn)動(dòng)情況并評(píng)分，處死大鼠并取腰段脊髓稱重檢測(cè)。切取脊髓組織時(shí)大鼠取俯臥位，于腰背正中做切口，由淺入深經(jīng)皮膚、筋膜至大鼠脊椎，由脊椎棘突分離附近肌肉，使用咬骨鉗等工具盡量完整取出L1-4的脊髓待測(cè)。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 大鼠脊髓組織病理學(xué)改變

取腰段脊髓做HE染色切片，由非本實(shí)驗(yàn)成員且熟悉脊髓切片的觀察者于顯微鏡下觀察，比較評(píng)估各組脊髓組織病理學(xué)結(jié)構(gòu)特征及差異。正常神經(jīng)元判斷標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞外形輪廓清晰、細(xì)胞核及尼氏體染色均勻。

1.4.2 大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分

術(shù)后24h根據(jù)脊髓損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(BBB)對(duì)各組大鼠后肢的運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行比較，重點(diǎn)觀察大鼠后肢各關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)情況和行走步態(tài)。0～7分：評(píng)價(jià)大鼠后肢的關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)功能；8～13分：評(píng)價(jià)大鼠整體協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)及行走步態(tài)；14～21分：評(píng)價(jià)大鼠爪子的精細(xì)運(yùn)動(dòng)情況。評(píng)分采用雙盲制，即每次分別由經(jīng)過學(xué)習(xí)培訓(xùn)后的兩人獨(dú)立完成，最終數(shù)據(jù)取兩人平均值。

1.4.3 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)

取腰段脊髓加入9倍體積的鹽水制成10%的勻漿，3000r/min離心10min，取上清液，采用分光光度法測(cè)定脊髓組織勻漿中 SOD的活性和MDA的含量，根據(jù)氮藍(lán)四唑(nitro-blue tetrazolium，NBT)光還原法測(cè)定SOD活性；根據(jù)硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)法測(cè)定MDA含量。其余詳細(xì)測(cè)定步驟參考兩者試劑盒內(nèi)的說明書。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)時(shí)使用SPSS 17.0軟件，按照(mean±SEM)的格式記錄數(shù)據(jù)。兩組間數(shù)據(jù)比較時(shí)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多樣本間數(shù)據(jù)比較時(shí)用單因素方差分析，當(dāng)涉及多重?cái)?shù)據(jù)比較時(shí)用LSD方法。如果所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不符合應(yīng)用單因素方差分析的條件，則應(yīng)用秩和檢驗(yàn)法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 大鼠脊髓組織病理學(xué)變化

假手術(shù)組鏡下細(xì)胞外形正常，核仁、尼氏體可見，組織中未見出血、水腫。SCII組可見大量神經(jīng)元細(xì)胞固縮、壞死，膠質(zhì)細(xì)胞增生，灰質(zhì)出血以及中性粒細(xì)胞浸潤。干預(yù)組可見神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，部分細(xì)胞核仁可見，空泡形成相對(duì)較少，未見明顯出血。

圖1 三組大鼠脊髓組織HE染色切片

2.2 大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分

由BBB評(píng)分法比較各組大鼠后肢的運(yùn)動(dòng)功能，重點(diǎn)記錄大鼠后肢各關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)情況和行走步態(tài)(詳見表1)。

表1 手術(shù)后24h大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分(n=10, mean±SEM)

數(shù)據(jù)顯示假手術(shù)組大鼠后肢未出現(xiàn)癱瘓。SCII組和干預(yù)組大鼠的后肢均出現(xiàn)不同程度的癱瘓。與假手術(shù)組相比，SCII組BBB評(píng)分顯著降低(19.33 vs 6.00，P<0.05)，提示造模成功。干預(yù)組的BBB分值相比假手術(shù)組也相應(yīng)降低(13.33 vs 19.33，P<0.05)，但明顯優(yōu)于SCII組(13.33 vs 6.00，P<0.05)，提示使用薯蕷皂苷元干預(yù)可明顯改善大鼠后肢運(yùn)動(dòng)情況。

2.3 大鼠脊髓氧化應(yīng)激指標(biāo)

圖2所示，與假手術(shù)組相比，SCII組和干預(yù)組大鼠脊髓組織中SOD水平均降低(6.34 vs 2.73，4.12，P<0.05)，MDA水平均升高(3.90 vs 9.80，6.63，P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示造模成功。與SCII組相比較，干預(yù)組大鼠脊髓組織中SOD水平顯著升高(2.73 vs 4.12，P<0.05)，MDA水平顯著降低(9.80 vs 6.63，P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示使用薯蕷皂苷元干預(yù)可以改善脊髓組織氧化應(yīng)激造成的損傷。

圖2 手術(shù)后24hSOD和MDA活力水平

3 討論

脊髓損傷作為一種嚴(yán)重的外科疾病，對(duì)人們生活質(zhì)量造成嚴(yán)重威脅，其中缺血再灌注造成的損傷致殘率、且致死率較高。前期研究發(fā)現(xiàn)脊髓組織較其他組織中含有較多不飽和脂肪酸，因此對(duì)氧自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化較為敏感，也更易受到自由基破壞。因此國內(nèi)學(xué)者普遍認(rèn)為氧化應(yīng)激是引起脊髓缺血再灌注損傷的重要病理機(jī)制之一，研究利用具有抗氧化作用的藥品拮抗氧自由基已成為研究的熱點(diǎn)，比如右美托咪定[4]等。

本研究通過手術(shù)持續(xù)夾閉大鼠腹主動(dòng)脈45min，構(gòu)建脊髓缺血再灌注模型，并用100mg/kg的薯蕷皂苷元進(jìn)行干預(yù)治療。實(shí)驗(yàn)以超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平作為檢驗(yàn)脊髓組織氧化損傷程度的指標(biāo)，探究薯蕷皂苷元的抗氧化功能在脊髓損傷中的保護(hù)作用。脊髓組織病理切片顯示，SCII組神經(jīng)元細(xì)胞固縮、壞死，可見大量空泡。根據(jù)脊髓損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分，SCII組和干預(yù)組大鼠均出現(xiàn)后肢功能障礙，表明大鼠SCII模型構(gòu)建成功。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說明，與假手術(shù)組相比，SCII組和干預(yù)組的SOD活性均降低，MDA水平均升高，這與葉勁濤等[5]的研究一致，考慮其原因可能為：血液再灌注時(shí)，氧自由基增多抑制超氧化物歧化酶等多種內(nèi)源性抗氧化酶活性，使其失去對(duì)氧自由基的清除能力；氧自由基增多還可引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，丙二醛作為脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物相應(yīng)增加，破壞細(xì)胞膜和線粒體的功能。與SCII組相比，使用薯蕷皂苷元干預(yù)后，大鼠脊髓組織中SOD活性提高，MDA水平降低。通過處理BBB評(píng)分，證明干預(yù)組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能顯著改善，以上均提示薯蕷皂苷元具有減輕脊髓損傷的作用。

綜上所述，薯蕷皂苷元對(duì)脊髓缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用，機(jī)制可能為薯蕷皂苷元通過抗氧化作用，減輕缺血再灌注所致的脊髓組織氧化應(yīng)激損傷。薯蕷皂苷元的來源較廣，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值，但有關(guān)薯蕷皂苷元改善脊髓損傷功能的具體細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制還需進(jìn)一步探討。