穆炳宇, 張淑娟, 李澤珍, 王 凱, 李紫輝, 薛建新*

1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，山西 晉中 030801 2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801

引 言

十字花科農(nóng)作物已成為全球種植最多的作物之一，其中花椰菜(BrassicaoleraceaL.botrytis)因其高產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益脫穎而出，其需求旺盛的主要原因是存在多種促進(jìn)健康的生物活性物質(zhì)，如芥子油苷，多酚或維生素C，為其可食部分增添了巨大的營養(yǎng)價(jià)值[1]。并且已發(fā)現(xiàn)花椰菜可有效預(yù)防慢性疾病，例如某些癌癥和心血管疾病[2]。然而，隨著種植面積和產(chǎn)量的不斷增加，花椰菜病害(灰霉病等)發(fā)生情況逐漸加重，使得花椰菜品質(zhì)受到影響。花椰菜灰霉病是由灰葡萄孢(Botrytis Cinerea Pers)引起的真菌性病害[3]。植物感染灰霉病之后，其組織表面會產(chǎn)生大量灰色霉層，造成大量減產(chǎn)[4]。因此實(shí)現(xiàn)對花椰菜灰霉病的早期檢測非常重要。

近紅外光譜技術(shù)作為無損檢測技術(shù)，檢測速度快、 效率高，在研究植物病害方面有很大的作用[5]。Anna等[6]使用高光譜成像技術(shù)檢測出感染灰霉病的草莓，所建模型的R2達(dá)到了0.85。有研究建立CARS-PCA-SVM模型，可實(shí)現(xiàn)對水稻感染稻瘟病早期和無病斑葉片的檢測。Bin等[7]使用光譜技術(shù)鑒別了真菌性病原體，為農(nóng)作物疾病的快速診斷和預(yù)警提供了技術(shù)參考。He等[8]使用近紅外光譜和計(jì)算機(jī)視覺在線無損檢測了受到脫氧性苯酚污染的小麥谷物。秦立峰等[9]對溫室黃瓜早期霜霉病光譜圖像田間采集存在的問題，提出融合病害差異信息的特征波段提取方法，建立了黃瓜霜霉病早期檢測模型。Shen等[10]使用NIR光譜技術(shù)鑒定受到不同濃度曲霉菌株污染的花生，實(shí)現(xiàn)了92.11%的正確分類率。Sun等[12]使用光譜技術(shù)檢測了接種灰霉菌的桃子，在36 h時對測試數(shù)據(jù)集的分類準(zhǔn)確率達(dá)到了97.5%。應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)對花椰菜灰霉病早期無病斑階段的檢測未見報(bào)道。

本工作以健康和感染灰霉病的花椰菜為研究對象，應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)，對花椰菜灰霉病早期分級檢測進(jìn)行研究，主要對染病但無病斑階段進(jìn)行檢測。先從外觀和品質(zhì)指標(biāo)上對早期染病花椰菜階段進(jìn)行判定，之后使用CARS算法對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行特征波段的提取，構(gòu)建花椰菜灰霉病的早期PLSR單一判別模型以及組合判別模型，目的是確定對花椰菜快速、 準(zhǔn)確的早期分類檢測模型，為花椰菜灰霉病的早期診斷提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 樣本制備

實(shí)驗(yàn)所用花椰菜品種為“松花”，于2020年10月采摘于大田地，當(dāng)天運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室并對花椰菜進(jìn)行篩選，以保證實(shí)驗(yàn)前花椰菜樣本的初始狀態(tài)相對一致，降低個體差異對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響[12]?；移咸焰?Botrytis Cinerea Pers)由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)研究中心提供，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato Dextrose Agar)培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)后[13]，配置成孢子濃度為1×106mL的孢子懸浮液。

將菜花用小刀(0.1%的次氯酸鈉溶液消毒)切成大小基本一致，約為3 cm的花球浸泡在1%的次氯酸鈉溶液中2 min，進(jìn)行消毒滅菌，取出后用無菌水清洗三次。用無菌的接種針在菜花上刺孔，深度3 mm，向孔中注入10 μL孢子菌懸液，自然晾干，放入墊有無菌紗布的滅菌密封托盤中，轉(zhuǎn)入溫度為21 ℃，相對濕度為90%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中貯藏。另有相等數(shù)量的花椰菜樣本經(jīng)消毒滅菌后轉(zhuǎn)入溫度為21 ℃，相對濕度為90%的同等環(huán)境下貯藏。分別在接種后0.5，1，2和3 d后取出對照和接菌樣本各76個，共608個樣本分批次進(jìn)行近紅外光譜和圖片信息的采集，隨機(jī)選取對照和接種樣本各9個用于測定品質(zhì)指標(biāo)。

1.2 儀器

采用美國ASD(Analytical Spectral Device)公司的Field Spec 3型光譜儀對花椰菜樣本光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行采集。光譜數(shù)據(jù)間隔為1 nm，光譜范圍為350～2 500 nm，采樣方式為漫反射。在使用前儀器至少預(yù)熱30 min，并置于暗箱中進(jìn)行黑白板校正。

1.3 光譜數(shù)據(jù)獲取與品質(zhì)指標(biāo)測量

使用Field Spec 3型光譜儀分別采集對照組花椰菜上表面中心點(diǎn)、 處理組花椰菜接種點(diǎn)位置的光譜數(shù)據(jù)。每個點(diǎn)位掃描3次，并取3次反射光譜平均值作為該樣本的光譜數(shù)據(jù)。之后每天對照組和處理組各取9個樣本進(jìn)行理化指標(biāo)的測定。多酚氧化酶(PPO)測定采用鄰苯二酚法，過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚法，具體操作參考文獻(xiàn)[14]； 丙二醛(MDA)測定參照張承等[15]的方法。為了減少儀器與外界環(huán)境等因素對光譜曲線的影響，去除兩端噪聲后，用500～2 400 nm波段的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[16]。

1.4 光譜數(shù)據(jù)處理方法

采用K-S算法(Kennard-Stone)劃分校正集和預(yù)測集。為了提高建模速度、 縮短建模時間，采用競爭性自適應(yīng)加權(quán)采樣法(competitive adaptive reweighted sampling，CARS)對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行特征波長的選擇。采用偏最小二乘回歸(partial least squares regression，PLSR)方法建模。選擇決定系數(shù)(determination coefficient，R2)和均方根誤差(root mean square error，RMSE)作為模型評價(jià)的指標(biāo)。數(shù)據(jù)處理軟件包括SPSS19.0(Version20.0，Inc.，Chicago，IL，USA)、 Matlab 2014 a (The MathWorks，USA)、 The Unscramber X10.1(CAMO ASA，Norway)，利用Origin2019b繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 外觀變化分析

花椰菜4個不同貯藏期(0.5，1，2和3 d)對照和接菌樣本如表1所示。隨著貯藏時間的延長，花椰菜樣本顏色逐漸變暗。第0.5 d與1 d的對照和處理組花椰菜樣本從外觀上看并無明顯差異，無法判別是否感染灰霉菌。而在第2 d，約有30%的接種花椰菜在接種點(diǎn)周圍出現(xiàn)黑斑，而到了第3 d時，已進(jìn)入花椰菜灰霉病高發(fā)期，約有80%的接種花椰菜已出現(xiàn)明顯的黑斑，可以用肉眼觀察出花椰菜是否染病。但是在2 d之前從外觀上不能直接觀察出花椰菜是否感染灰霉病。

表1 貯藏期花椰菜樣本圖

2.2 品質(zhì)指標(biāo)分析

花椰菜樣本在貯藏期間品質(zhì)指標(biāo)(PPO，POD，MDA)平均值、 均方根誤差以及顯著性分析如表2所示。POD在0.5～1 d一直處于升高的狀態(tài)，在1 d到達(dá)最高值后開始下降，處理組的POD上升速率和下降速率均高于對照組，并在第3 d達(dá)到最低。PPO在貯藏初期呈現(xiàn)上升趨勢，在2 d時達(dá)到最高峰后開始下降，處理組花椰菜在第2 d與3 d時的PPO值遠(yuǎn)大于對照組。從0.5 d到3 d，對照組和處理組的MDA值均在一直上升。

PPO活性的變化即為組織褐變發(fā)生的進(jìn)程，POD活性的提高則有效抑制灰霉菌的侵染，切分時的機(jī)械操作對細(xì)胞造成傷害并提高了酶的活性，而后期伴隨著花椰菜的衰老與抵御病害的失敗以及病害的進(jìn)一步發(fā)展，PPO和POD酶的活性逐漸降低。在整個貯藏期間，MDA值的含量一直在增加，這是因?yàn)榧?xì)胞膜透性增大，花椰菜處于不斷衰老的進(jìn)程中。

表2 貯藏期花椰菜品質(zhì)指標(biāo)的變化Table2 Changes of cauliflower quality indexes during storage

從表2可知，在0.5 d時，接種花椰菜和對照花椰菜樣本的理化指標(biāo)并無顯著性差異，測量值差距較小； 而到了第1 d時，僅有MDA在處理組和對照組之間出現(xiàn)了顯著性差異，無法從第1 d的樣本來區(qū)分花椰菜是否感染灰霉病； 在第2 d時，POD，PPO和MDA三個指標(biāo)均出現(xiàn)了顯著性差異，且處理組均值都高于對照組； 第3d時，對照組的POD均值高于處理組，而POD和MDA均值低于處理組，表明接菌的花椰菜樣本衰老速度高于對照組，從第2 d，品質(zhì)指標(biāo)就可以檢測出花椰菜是否感染灰霉病，但是仍無法有效判別第0.5 d和1 d的患病花椰菜。

2.3 花椰菜樣本近紅外反射光譜特征分析

圖1是每個貯藏天數(shù)(0.5，1，2和3 d)，所有健康和染病“松花”花椰菜樣本在500～2 400 nm波段的平均光譜反射曲線。從圖1可知： 隨著貯藏期的延長，對照組和處理組花椰菜樣本平均光譜反射率逐漸升高，光譜反射曲線趨勢大致相同，但不同樣本的吸收峰強(qiáng)度不同。從圖中可知，不同天數(shù)的花椰菜光譜圖在980，1 180，1 260，1 450，1 660，2 250 nm都出現(xiàn)了吸收峰，其中980和1 180 nm為O—H鍵的二級倍頻峰，1 450 nm為O—H鍵的一級倍頻峰，1 660和2 250 nm處的吸收峰則與C—H鍵和C—O鍵有關(guān)。

圖1 花椰菜樣本平均反射光譜圖Fig.1 Average reflection spectrum of cauliflower sample

2.4 花椰菜灰霉病早期檢測模型建立與分析

2.4.1 花椰菜樣本集數(shù)據(jù)劃分

將每一天的花椰菜樣本(健康76個、 染病76個)光譜信息使用K-S算法按照3∶1劃分為校正集(114個樣本)和預(yù)測集(38個樣本)。

2.4.2 基于CARS算法的花椰菜樣本特征波長選擇

CARS算法是效仿達(dá)爾文進(jìn)化理論中“適者生存”的原理提出的變量選擇理論[17]，既可以去除無信息變量，也可以減少共線性變量對模型的影響。在實(shí)際特征波長選擇過程中，保留PLSR模型中回歸系數(shù)絕對值大的波長變量，去除絕對值小的變量，多次篩選后可以獲得一系列變量子集，之后采用交叉驗(yàn)證的方法建模，獲得模型交叉驗(yàn)證均方根誤差最小的變量子集，即為最優(yōu)波長變量子集。

表3 CARS算法提取的特征波長Table 3 Characteristic wavelength tableextracted by CARS algorithm

采用CARS算法對每天的花椰菜樣本數(shù)據(jù)提取特征波長，由表3可知，0.5～3 d的4個批次特征波長個數(shù)依次為11，10，10和9個，每個貯藏時間內(nèi)大多數(shù)特征波段并不相同，分析認(rèn)為隨著貯藏時間的延長，花椰菜內(nèi)所含酶活性變化，MDA含量上升，而這些物質(zhì)內(nèi)部含有的O—H，C—O和C—H鍵時刻處在動態(tài)變化中。僅有少數(shù)波長重復(fù)。其中0.5和2 d重復(fù)的波長為1 874 nm，0.5和3 d重復(fù)的波長為2 354和2 383 nm。

2.4.3 CARS特征波長PLSR單一批次建模

將4個單一批次特征波段數(shù)據(jù)為自變量，以花椰菜的好壞類別為因變量，建立基于近紅外光譜的PLSR判別模型。目的是驗(yàn)證使用近紅外光譜能否實(shí)現(xiàn)對早期感染灰霉病花椰菜的判別，以此建立的PLSR模型預(yù)測結(jié)果如表4所示。

表4 CARS特征波長PLSR單一批次建模Table 4 CARS characteristic wavelength PLSRsingle batch modeling

2.4.4 CARS特征波長PLSR組合批次建模

將花椰菜樣本4個批次(0.5～3 d)通過CARS算法提取的特征波段(共37個)組合起來作為自變量，以花椰菜的好壞類別為因變量，進(jìn)行基于PLSR算法的組合批次建模，提高模型的泛化能力和檢測效率，并以此來判別單一批次花椰菜是否患病。

表5 CARS特征波長PLSR組合批次建模Table 5 CARS characteristic wavelength PLSRcombined batch modeling

使用0.5 d單一批次特征波段所建模型判別準(zhǔn)確率達(dá)到了94.74%，而組合批次特征波段PLSR算法所建模型在0.5 d時判別準(zhǔn)確率僅為92.11%，差距達(dá)到2.63%，1 d單一批次特征波段建模已達(dá)100%識別率，而1 d組合批次特征波段所建模型驗(yàn)證時仍有1個誤判； 同樣使用組合批次特征波段建立基于PLSR算法的模型預(yù)測第2 d和第3 d時，預(yù)測均方根誤差低于單一批次特征波段建模，表明PLSR組合批次模型效果劣于PLSR單一批次模型。

利用可見/近紅外光譜技術(shù)對花椰菜灰霉病進(jìn)行早期檢測。通過CARS算法進(jìn)行特征波段的提取，既可以提取病害的特征信息，又可以對冗余數(shù)據(jù)進(jìn)行剔除； 通過PLSR建立相應(yīng)的病害判別模型，對單一批次的花椰菜樣本進(jìn)行檢測； 將CARS單一批次提取的特征波段組合進(jìn)行總體PLSR建模，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所有模型的樣本判別準(zhǔn)確率全部大于92.11%，精度較高。CARS-PLSR單一批次模型可有效判別花椰菜是否感染灰霉病，對染病僅0.5 d的花椰菜檢測精度達(dá)到94.74%，比使用組合批次波段的整體模型高2.63%，輸入變量僅僅有11個； 對染病1 d之后的花椰菜檢測精度均達(dá)到100%。組合批次波段的整體建模在染病1 d時判別準(zhǔn)確率達(dá)到了97.37%，處于較高水平，但輸入變量達(dá)到了37個，且效果差于單一批次模型，該模型在染病2d之后對花椰菜檢測精度也可達(dá)到100%。因此，綜合評價(jià)CARS-PLSR單一批次模型為最優(yōu)模型，其各天準(zhǔn)確率分別為94.74%，100%，100%和100%。

3 結(jié) 論

基于花椰菜感染灰霉病，在肉眼無法觀察以及品質(zhì)指標(biāo)沒有顯著性差異時，使用近紅外光譜對花椰菜是否患病進(jìn)行了早期判別檢測，取得較好的效果。結(jié)果表明近紅外光譜可有效判別健康與感染灰霉病的花椰菜。為已經(jīng)感染灰霉病但是仍處于早期無病斑階段的花椰菜檢測提供了新思路，為花椰菜灰霉病檢測、 早期防治與科學(xué)用藥提供了參考，也為開發(fā)實(shí)時、 便攜病害檢測儀器提供理論支持。