邱 旭, 許薷方, 魏士平, 湯熙翔*

(1. 中國地質(zhì)大學(xué)(北京)海洋學(xué)院, 北京 100083; 2. 自然資源部第三海洋研究所, 福建 廈門 361005)

深海是全球最大的獨(dú)立生態(tài)系統(tǒng), 是指水深超過1 000 m的區(qū)域, 包括深層海水、表層沉積物、冷泉、熱液以及多金屬結(jié)核區(qū)等特殊生境[1-2]。相對(duì)于陸地微生物, 深海及深海沉積物中的微生物面臨高壓、低溫、黑暗及低營養(yǎng)水平等多種極端環(huán)境[3]。在這些環(huán)境中生存著的微生物由于長期適應(yīng)極端條件而進(jìn)化成為相應(yīng)的極端微生物[4-5]。

在深海中, 最典型的環(huán)境因素為低溫(2～4 ℃)、高壓(平均38.5 MPa)以及熱液區(qū)和硫化物區(qū)的極端氧化還原梯度環(huán)境。極端微生物研究有著較為廣闊的前景。極端微生物本身蘊(yùn)藏的獨(dú)特基因是極其寶貴的資源；極端環(huán)境適應(yīng)性蛋白和極端酶的應(yīng)用價(jià)值巨大；極端環(huán)境微生物在環(huán)境修復(fù)、資源利用、生物煉制和生物冶金等領(lǐng)域的應(yīng)用前景廣闊；極端環(huán)境微生物研究也是生物圈與地圈協(xié)同演化、生命與環(huán)境相互作用等重大科學(xué)問題的基礎(chǔ)[6]。

深海沉積微桿菌MicrobacteriumsediminisYLB-01是分離自西南印度洋沉積物中的一株革蘭氏陽性放線菌。菌落呈白色、邊緣光滑的球狀。菌株有一定的低溫、高壓耐受性，溫度生長范圍為4～50 ℃ (最適28 ℃), 壓力生長范圍為0.1～80.0 MPa (最適0.1 MPa), NaCl耐受范圍為0%～8% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)，最適5%), pH生長范圍為5.0～10.0 (最適pH 7.0)[7]。

已有轉(zhuǎn)錄組和代謝組的研究表明,M.sediminisYLB-01的冷適應(yīng)與氨基酸和碳水化合物代謝密切相關(guān)。在低溫環(huán)境下YLB-01會(huì)表現(xiàn)出冷應(yīng)激, 且碳水化合物代謝明顯紊亂。同時(shí), 其對(duì)數(shù)生長期的三羧酸循環(huán)受到抑制, 而平臺(tái)期細(xì)胞表現(xiàn)為丙酮酸減少和乳酸增加[8]。

本研究旨在通過對(duì)M.sediminisYLB-01進(jìn)行常壓室溫等離子體誘變(Atmospheric and Room Temperature Plasma, ARTP), 篩選出突變后對(duì)低溫和高壓敏感的突變子并進(jìn)行重測(cè)序, 分析其突變位點(diǎn)和突變類型等信息, 為研究M.sediminisYLB-01的低溫、高壓環(huán)境適應(yīng)性機(jī)制提供幾種研究方向與思路, 為進(jìn)一步闡明其低溫高壓適應(yīng)性機(jī)理提供佐證, 為深部生物圈生物的環(huán)境適應(yīng)性機(jī)制提供線索。

1 材料與方法

1.1 菌株

本研究采用的菌株M.sediminisYLB-01為課題組保種。

1.2 試劑

實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基為胰蛋白胨大豆肉湯(TSA)：胰蛋白胨大豆肉湯粉30 g, 溶于超純水, 定容至1 L(固體培養(yǎng)時(shí)再加入15 g的瓊脂), 121 ℃高壓滅菌20 min。試劑包括體積分?jǐn)?shù)為50%的甘油(無菌)和過濾除菌的氟化液(比利時(shí)Fluorinert, FC-40)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

實(shí)驗(yàn)儀器包括常壓室溫等離子體人工誘變儀(無錫源清天木, ARTP-M)、高壓微生物培養(yǎng)釜加壓裝(南通飛宇)、酶標(biāo)儀(美國伯樂, Model 680)、超凈工作臺(tái)(蘇凈安泰, VT-840-V)、滅菌鍋(日本Hirayama, HVE-50)、恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒, LRH-150)、搖床(上海旻泉, MQT-60R)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 ARTP誘變 取50 μL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(OD600=0.6)的菌液滴加在無菌的不銹鋼板上, 并在無菌空氣中干燥幾分鐘。調(diào)節(jié)設(shè)備輸入氦氣流速為15 L/min, 功率為100 W, 菌液在此條件下分別處理20、40、60、80、100、120 s, 每種條件做3個(gè)重復(fù)。將處理過后的菌體用2 mL的無菌生理鹽水洗脫, 重懸后取200 μL涂布于固體平板上, 28 ℃, 0.1 MPa培養(yǎng)至長出單菌落[9-11]。

1.4.2 初篩 挑取固體平板上長出的單克隆, 分別接種于裝有無菌TSA培養(yǎng)基的96深孔板中, 28 ℃, 0.1 MPa, 180 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。向?qū)?shù)期的單克隆菌液中加入等量無菌的50%甘油進(jìn)行保種。

低溫敏感突變子篩選：分別取保種的菌液以1∶10進(jìn)行復(fù)蘇, 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后再次以1∶10接種于1.5 mL培養(yǎng)基中, 4 ℃, 0.1 MPa, 180 r/min培養(yǎng)15 d。15 d后分別取200 μL菌液測(cè)定OD600, 每個(gè)菌液3個(gè)重復(fù)。

高壓敏感突變子篩選：分別取保種的菌液以1∶10進(jìn)行復(fù)蘇, 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后再次以1∶10接種于1.5 mL培養(yǎng)基中。對(duì)充氧2 h的氟化液進(jìn)行過濾除菌, 并與菌液以2∶1的比例混合, 取無菌的巴斯德管分別吸入菌液, 排盡空氣后熱封口。將巴斯德管至于高壓微生物培養(yǎng)釜中, 加壓至30.0 MPa, 28 ℃條件下培養(yǎng)30 d。30 d后分別取200 μL菌液測(cè)定OD600, 每個(gè)菌液3個(gè)重復(fù)。

1.4.3 復(fù)篩 根據(jù)初篩結(jié)果篩選出在低溫(4 ℃)、高壓(30.0 MPa)條件下生長顯著受限制的可疑突變子, 再根據(jù)初篩的步驟再次進(jìn)行篩選, 每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)。

1.4.4 突變子重測(cè)序及比較基因組分析 篩選出對(duì)低溫、高壓敏感的突變子后, 采用細(xì)菌通用引物27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 獲得突變子的16S rRNA序列, 并在NCBI (National Center Biotechnology Information)網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。提取突變子基因組DNA并進(jìn)行重測(cè)序。采用高通量測(cè)序得到原始圖像數(shù)據(jù)文件, 經(jīng)過轉(zhuǎn)化、過濾等處理得到Clean Data用于后續(xù)分析。測(cè)序數(shù)據(jù)上傳至NCBI的序列歸檔數(shù)據(jù)庫(Sequence Read Archive, SRA)。使用BWA (版本0.7.17)、SAMTOOLS (版本0.1.19)、Circos (版本0.69)以及BreakDancer (版本1.4.5)等軟件, 將測(cè)序數(shù)據(jù)與野生型基因組進(jìn)行序列比對(duì), 分析突變位點(diǎn)和片段信息[12-15]。利用直系同源蛋白簇?cái)?shù)據(jù)庫(Clusters of Orthologous Groups of Proteins, COG)對(duì)變異基因進(jìn)行注釋, 獲得突變基因。

2 結(jié)果與討論

2.1 突變子9-3E5具有低溫、高壓敏感性

對(duì)采用ARTP人工誘變處理后的突變子進(jìn)行了低溫、高壓敏感性測(cè)試。結(jié)果表明, 突變子9-3E5在28 ℃條件下生長狀況良好, 但對(duì)于低溫、高壓條件較為敏感(圖1)。

以菌株生長達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)的OD600值作為菌株生長情況的判定標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果(圖1)顯示, 在28 ℃, 0.1 MPa條件下培養(yǎng), 野生株YLB-01與突變子9-3E5均能較好生長, 9-3E5的OD600可達(dá)0.80；在28 ℃, 30.0 MPa(常溫高壓)條件下培養(yǎng), 野生株YLB-01生長良好(OD600=0.50), 而突變子9-3E5生長明顯受限(OD600=0.15)；在4 ℃, 0.1 MPa (低溫常壓)條件下培養(yǎng), 野生株YLB-01的OD600為0.25, 突變子9-3E5生長明顯受限(OD600=0.10)。野生株YLB-01在低溫和高壓條件下雖然生長會(huì)受到一定限制, 但仍能存活和生長, 即能夠耐受低溫和高壓極端環(huán)境；而對(duì)于突變子9-3E5, 無論是4 ℃的低溫條件還是30.0 MPa的高壓環(huán)境, 其生長量相較于野生型菌株YLB-01大幅減少, 幾乎不生長。

對(duì)應(yīng)4 000～5 000 t銅陽極泥，年產(chǎn)浮選尾礦1 500～1 800 t，潛在的回收經(jīng)濟(jì)價(jià)值為6 000余萬元。銅陽極泥浮選尾礦現(xiàn)處理工藝為返回銅冶煉艾薩系統(tǒng)處理，僅有銅冶煉煙塵開路，流程中不斷循環(huán)、富集的鉛、銻、鉍、碲對(duì)銅產(chǎn)品質(zhì)量的控制存在隱患。同時(shí)，浮選尾礦中少量的貴金屬在銅冶煉流程中分散損失，這也影響了銅冶煉系統(tǒng)的金銀回收率?；谫Y源綜合回收的背景，銅陽極泥浮選尾礦中鉛、銻、鉍、碲的回收將具有長遠(yuǎn)效益。

圖1 野生株YLB-01與突變子9-3E5常溫常壓、常溫高壓和低溫常壓環(huán)境下生長情況對(duì)比

2.2 突變子9-3E5與野生型的比較基因組分析

對(duì)突變子9-3E5進(jìn)行了全基因組序列的重測(cè)序, 并與參考基因組序列(YLB-01)進(jìn)行了比對(duì)分析。突變子9-3E5的16S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物長為1 370 bp, 經(jīng)BLAST比對(duì), 與野生株(YLB-01)的相似度達(dá)99%, 表明突變子9-3E5來源于YLB-01。重測(cè)序基因組數(shù)據(jù)顯示, 突變子9-3E5基因組數(shù)據(jù)[NCBI登錄號(hào)(SRA)：SRR10828178]與野生型基因組(NCBI登錄號(hào)：CP038256)數(shù)據(jù)比對(duì)率達(dá)88.8%, 錯(cuò)配率僅有0.5%。測(cè)序深度在基因組上分布均衡, 平均覆蓋度為228 bp；測(cè)序覆蓋度大于等于1X、4X、10X的區(qū)域占參考序列基因組的比例均在99.5%以上, 表示本次重測(cè)序覆蓋率高, 結(jié)果可信(表1)。

表1 樣品與參考序列的覆蓋度統(tǒng)計(jì)

2.3 突變子9-3E5的全基因組變異圖譜

使用Circos軟件結(jié)合測(cè)序Reads對(duì)參考序列的覆蓋情況和單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNP)、插入缺失標(biāo)記(Insertion Deletion, InDel)進(jìn)行分析, 以參考序列為標(biāo)尺, 把Reads覆蓋情況和SNP、InDel的分布情況展示到環(huán)形的變異圖譜上[14]。圖2為突變子9-3E5全基因組變異圖譜, SNP和InDel在突變子全基因組上分布均勻，SNP突變率較高。

圖2 突變子9-3E5的全基因組變異圖譜

2.4 突變子9-3E5的SNP檢測(cè)

采用SAMTOOLS進(jìn)行個(gè)體SNP的檢測(cè)[13]。結(jié)果顯示, 突變子9-3E5全基因組中共檢測(cè)到了1 082個(gè)SNP位點(diǎn), 位點(diǎn)密度為0.39 SNP/kb。其中發(fā)生轉(zhuǎn)換的位點(diǎn)305個(gè), 顛換的位點(diǎn)777個(gè), 轉(zhuǎn)換位點(diǎn)數(shù)量不足顛換位點(diǎn)數(shù)量的二分之一, 轉(zhuǎn)換顛換率0.39。有182個(gè)SNP位點(diǎn)位于基因間區(qū), 59個(gè)SNP位點(diǎn)位于編碼區(qū)且為同義突變, 838個(gè)SNP位點(diǎn)位于編碼區(qū)且為非同義突變, 編碼區(qū)非同義突變位點(diǎn)數(shù)量占總SNP數(shù)量的77.45%, 是同義突變位點(diǎn)數(shù)量的14.2倍。

2.5 突變子9-3E5的InDel檢測(cè)及注釋

基因組中小片段的插入或缺失若導(dǎo)致移碼突變將改變所編碼蛋白的結(jié)構(gòu)與功能。采用SAMTOOLS軟件對(duì)小于50 bp的小片段的插入或缺失進(jìn)行了檢測(cè), 共檢測(cè)出了27個(gè)InDel, 其中有7個(gè)發(fā)生在基因間區(qū)。24個(gè)為插入突變, 3個(gè)為缺失突變, 在基因編碼區(qū)且發(fā)生移碼突變的共有11個(gè)InDel。

2.6 突變子9-3E5的SV類型個(gè)數(shù)及長度分布

用BreakDancer軟件[15]檢測(cè)了突變子9-3E5與參考基因組相比, 發(fā)生了插入、缺失、倒置、染色體內(nèi)部遷移、染色體間的遷移的序列。結(jié)果顯示突變子9-3E5共有11條染色體結(jié)構(gòu)變異(Structure Variation, SV)序列, 其中2條是染色體內(nèi)部遷移, 9條是染色體間遷移。11條SV序列中, 長度在200～300 bp的序列占比為18.18%, 長度在300～400 bp的序列占比為81.82%。

2.7 突變子9-3E5 SNP和InDel變異富集

利用COG數(shù)據(jù)庫對(duì)細(xì)菌變異基因進(jìn)行注釋分析, 共注釋到了23個(gè)分類(表2)。以O(shè)R(Odds Ratio)值>2、p<0.05 為富集標(biāo)準(zhǔn), 富集到3個(gè)功能集：細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分裂和染色體分裂功能集(OR值=2.419 0,p=0)；復(fù)制、重組和修復(fù)功能集(OR值=2.149 2,p=0)；胞內(nèi)運(yùn)輸、分裂和囊泡轉(zhuǎn)移功能集(OR值=2.506 5,p=0)。表明突變子9-3E5相對(duì)于野生株耐冷、耐壓性狀改變主要原因可能與細(xì)胞分裂、修復(fù)、胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)认嚓P(guān)功能基因發(fā)生突變有關(guān)。

表2 突變子9-3E5 SNP和InDel變異富集結(jié)果

續(xù)表2

表3 9-3E5編碼區(qū)與富集的3個(gè)功能集相關(guān)基因的SNP突變統(tǒng)計(jì)

續(xù)表3

2.8 討論

突變子9-3E5與野生型菌株比較基因組分析提示, 細(xì)胞分裂、復(fù)制修復(fù)以及胞內(nèi)運(yùn)輸相關(guān)基因發(fā)生的突變可能是其相對(duì)于野生型菌株耐壓耐冷性狀改變的原因。

突變子9-3E5基因組中與細(xì)胞分裂、復(fù)制修復(fù)以及胞內(nèi)運(yùn)輸相關(guān)基因的突變主要有3種：一種是脯氨酸突變成其他氨基酸(如蘇氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺等), 這種突變由于脯氨酸一般位于蛋白轉(zhuǎn)角處, 所以突變發(fā)生后極有可能會(huì)改變其所編碼蛋白的結(jié)構(gòu)[16]；一種是不帶電荷氨基酸突變成帶電荷氨基酸, 如不帶電甘氨酸突變成帶負(fù)電谷氨酸和堿性組氨酸突變成不帶電天冬酰胺, 這種突變可能會(huì)因?yàn)榘被崴鶐щ姾傻母淖兌绊懙鞍椎牡入婞c(diǎn)；還有一種是極性氨基酸和非極性氨基酸之間的突變, 如極性絲氨酸突變成非極性異亮氨酸和極性甘氨酸突變成非極性纈氨酸, 這種突變可能會(huì)造成蛋白親水性的變化。這些突變極有可能改變蛋白的結(jié)構(gòu)、等電點(diǎn)和親水性, 從而影響到蛋白的功能。

2.8.1 突變子與細(xì)胞分裂相關(guān)基因發(fā)生突變 細(xì)菌細(xì)胞的分裂過程同一系列的細(xì)胞分裂蛋白相關(guān), 是一個(gè)較為復(fù)雜的過程[17]。有研究表明, 細(xì)菌在進(jìn)行分裂前會(huì)有蛋白復(fù)合體產(chǎn)生為后續(xù)的分裂過程做準(zhǔn)備。不同種屬細(xì)菌的細(xì)胞分裂蛋白復(fù)合體組分大致相同, 其基本組成為12個(gè)細(xì)胞分裂基本蛋白和15個(gè)輔助蛋白[18]。細(xì)菌細(xì)胞分裂涉及到的蛋白主要有FtsA、FtsB、FtsE、FtsI、FtsK、FtsL、FtsN、FtsQ、FtsW、FtsX、FtsZ等[17]。FtsA能夠形成原纖維絲[19]；FtsI參與肽聚糖的合成與細(xì)胞壁交聯(lián)[20-21]；FtsK是DNA移位酶； FtsN與隔膜形成有關(guān)[22-26]；FtsW是脂質(zhì)翻轉(zhuǎn)酶，同時(shí)也是細(xì)胞壁前體細(xì)胞的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[27-28]；FtsZ主要功能是促進(jìn)蛋白復(fù)合體骨架的形成, 并促進(jìn)細(xì)胞收縮[29-31]。

通過對(duì)突變子9-3E5基因組數(shù)據(jù)分析, 有4個(gè)細(xì)胞分裂相關(guān)基因發(fā)生了非同義突變, 所編碼的蛋白分別為細(xì)胞分裂蛋白FtsI、FtsW、FtsX和細(xì)胞分裂起始蛋白。FtsI、FtsW、 FtsX以及細(xì)胞分裂起始蛋白的編碼基因發(fā)生突變, 極有可能影響了這些蛋白的結(jié)構(gòu)或功能特性, 影響了細(xì)菌在極端環(huán)境下的分裂, 從而影響了突變子對(duì)于低溫、高壓環(huán)境的耐受性。閆文娟等(2013)的研究結(jié)果指出, FtsW在細(xì)菌處于熱應(yīng)激時(shí)表達(dá)增高且主要由細(xì)菌的熱應(yīng)激誘導(dǎo)[32]。我們?cè)谕蛔冏又袡z測(cè)到FtsW的編碼基因發(fā)生了突變, 極有可能影響了YLB-01在低溫環(huán)境下的細(xì)胞分裂, 從而改變了其低溫耐受性。但低溫耐受性的改變是否只與FtsW蛋白的突變的有關(guān)尚不能確定。菌株YLB-01對(duì)于高壓環(huán)境的耐受可能也與細(xì)胞分裂有關(guān), 但具體是4種蛋白中的哪種或哪幾種的改變?cè)斐闪似涓邏哼m應(yīng)性改變尚未能闡明, 還有待進(jìn)一步的基因定點(diǎn)突變和回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)等進(jìn)行驗(yàn)證。

2.8.2 突變子與DNA修復(fù)、復(fù)制相關(guān)基因發(fā)生突變 生活在深海中的微生物, 其生命過程不可避免的要受到高壓這一嚴(yán)苛環(huán)境因素的影響。已有的研究表明高壓會(huì)影響到DNA氫鍵的穩(wěn)定性, 同時(shí)也會(huì)造成DNA損傷[33]。DNA中氫鍵穩(wěn)定性的提高會(huì)造成單鏈轉(zhuǎn)換為雙鏈需要的溫度升高, 影響到細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、修復(fù)等過程, 而深海(除熱液區(qū)外)又是典型的低溫環(huán)境，高壓與低溫同時(shí)存在無疑會(huì)對(duì)深海微生物的正常生命活動(dòng)造成重大影響。突變子9-3E5的基因組中, 與細(xì)胞內(nèi)DNA損傷修復(fù)相關(guān)的功能集共有6個(gè)突變基因, 涉及到10個(gè)非同義突變。

在大腸桿菌中, SOS反應(yīng)是一種細(xì)胞對(duì)DNA損傷的應(yīng)激反應(yīng), 目的是為了增加在不利環(huán)境條件下的存活率。DNA聚合酶III是由至少10個(gè)亞基組成的復(fù)合體, 而DNA聚合酶III的β亞基作為輔助蛋白, 功能是賦予聚合酶高催化活性和高加工性[34-36]；DNA復(fù)制/修復(fù)蛋白R(shí)ecF對(duì)于DNA斷裂和缺口的重組修復(fù)十分重要,能促進(jìn)dsDNA斷裂的重組修復(fù)[37-39]；易錯(cuò)DNA聚合酶通過促進(jìn)跨損傷DNA合成在細(xì)菌DNA損傷、耐受中發(fā)揮重要作用[40-44]; DNA回旋酶A亞基是在復(fù)制過程中將復(fù)制好的DNA雙鏈變?yōu)樘烊坏呢?fù)超螺旋的構(gòu)型；ATP依賴性RNA解旋酶HrpA, 與翻譯起始、核糖體形成、前mRNA拼接和mRNA降解的許多進(jìn)程都有著密切關(guān)聯(lián)；在嘌呤生物合成中, 氨基咪唑羧酰胺核肽(Aminoimidazole Carboxamide Nuclear Peptide, AICAR)是雙功能磷酸核糖氨基咪唑羧酰胺甲酰轉(zhuǎn)移酶/IMP環(huán)水解酶的底物[45]。這幾個(gè)與DNA損傷修復(fù)相關(guān)的基因發(fā)生了突變, 可能造成了9-3E5細(xì)胞在高壓下的DNA損傷無法正常修復(fù)；基因復(fù)制、翻譯相關(guān)基因發(fā)生突變, 表明細(xì)胞內(nèi)的翻譯過程和核糖體的形成可能受到影響, 嘌呤的生成可能也受到了阻礙, 9-3E5細(xì)胞內(nèi)DNA的正常復(fù)制過程受到了抑制, 從而對(duì)高壓低溫環(huán)境失去耐受性。結(jié)果提示, YLB-01的高壓和低溫環(huán)境耐受性可能與其細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)以及維持細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制翻譯過程的正常運(yùn)行有關(guān)。

2.8.3 突變子與胞內(nèi)運(yùn)輸相關(guān)基因發(fā)生突變 突變子9-3E5的基因組中, 與胞內(nèi)運(yùn)輸相關(guān)的功能集有2個(gè)突變基因, 涉及到3個(gè)非同義突變。其一是糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)，在細(xì)胞內(nèi)的功能主要是介導(dǎo)碳水化合物的吸收和磷酸化, 控制碳氮代謝以響應(yīng)糖的供應(yīng)[46-49]。另一個(gè)是葡萄糖-1-磷酸腺苷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng), 主要和ATP的生成有關(guān)[50]。

細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的代謝過程是其細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的消耗路徑, 細(xì)胞通過一系列的代謝過程將胞內(nèi)的糖類、脂類、氨基酸等物質(zhì)進(jìn)行代謝消耗, 進(jìn)而生成ATP以供應(yīng)細(xì)胞的正常生命活動(dòng)。富集到的胞內(nèi)運(yùn)輸功能集涉及的基因與代謝過程或能量生成相關(guān), 這兩類基因發(fā)生突變可能意味著細(xì)胞內(nèi)的代謝過程及能量生成過程受到影響, 提示我們YLB-01的低溫高壓耐受性可能與細(xì)胞內(nèi)代謝途徑和能量生成途徑的調(diào)控有關(guān)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)一株耐冷、耐壓的深海沉積微桿菌M.sediminisYLB-01進(jìn)行ARTP誘變, 得到了對(duì)低溫、高壓敏感的突變子9-3E5。對(duì)突變子進(jìn)行了基因組重測(cè)序與突變情況分析。 結(jié)果表明, 突變子9-3E5低溫和高壓耐受性改變的原因可能是由于基因組中與細(xì)胞分裂、復(fù)制修復(fù)以及胞內(nèi)運(yùn)輸相關(guān)的基因發(fā)生了非同義點(diǎn)突變。相關(guān)基因發(fā)生突變對(duì)于YLB-01可能主要有以下3種影響：影響了細(xì)胞的正常分裂過程；在面對(duì)高壓帶來的DNA損傷時(shí), DNA損傷修復(fù)以及正常的轉(zhuǎn)錄翻譯過程也受到了影響；細(xì)胞內(nèi)的代謝過程和能量生成受到了調(diào)控。突變子9-3E5相對(duì)于野生型菌株YLB-01的這3點(diǎn)改變可能造成了其對(duì)低溫、高壓環(huán)境較為敏感。這也揭示M.sediminisYLB-01對(duì)于低溫和高壓環(huán)境的耐受性機(jī)制可能與細(xì)胞分裂過程、DNA損傷修復(fù)和復(fù)制翻譯過程、胞內(nèi)運(yùn)輸調(diào)控能量合成這3方面生命過程發(fā)生了改變有關(guān)。本研究為進(jìn)一步闡明M.sediminisYLB-01的低溫高壓的適應(yīng)性機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。