茍偲鈺，葉志林，江天久

(暨南大學(xué)赤潮與海洋生物學(xué)研究中心、水體富營養(yǎng)化與赤潮防治廣東省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510632)

卵圓卡盾藻(Chattonellaovata)是魚毒性赤潮原因種之一。2001年在我國大鵬灣首次記載了卵圓卡盾藻赤潮[1]，此后，日本和墨西哥相繼報(bào)道了該藻引發(fā)的赤潮會導(dǎo)致養(yǎng)殖魚類大量死亡，海產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)損失巨大[2-3]。研究表明，魚毒性赤潮藻產(chǎn)生的溶血毒素是引起魚類死亡的重要原因之一，但其具體的致毒機(jī)理和毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)成分尚不清楚[4]。藻細(xì)胞葉綠素三維熒光技術(shù)可以準(zhǔn)確識別魚毒性藻類和非魚毒性藻類并判別魚毒性藻類毒性的高低[5]，提示藻類的光合作用系統(tǒng)可能在魚毒性藻類產(chǎn)毒中具有重要作用，為此，需進(jìn)一步探討藻類的光合色素與藻類溶血活性間的關(guān)系。銅和鎂離子在藻類葉綠素合成或光合電子傳遞中具有重要作用，本研究通過調(diào)控培養(yǎng)液中上述兩種離子的濃度，研究其對卵圓卡盾藻生長、光合色素含量及其溶血活性的影響，進(jìn)一步探討溶血毒素與光合色素的關(guān)系，旨在為卵圓卡盾藻溶血毒素的產(chǎn)生機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

1.1.1 溶血毒素提取緩沖液 分別稱取0.238 g KCl、8.775 g NaCl、0.551 g CaCl2·2H2O、0.150 g MgSO4和1.476 g TRIS定容至1 dm3高純水中，用0.1 mol/dm3HCl調(diào)pH至7.4，儲存于4 ℃條件下備用。

1.1.2 兔血紅細(xì)胞緩沖液 分別稱取0.200 g KCl、8.000 g NaCl、 0.215 g KH2PO4和3.580 g Na2HPO4·12H2O定容至1 dm3高純水中，用0.1 mol/dm3HCl調(diào)pH至7.4，儲存于4 ℃條件下備用。

1.1.3 0.5%兔血紅細(xì)胞溶液 取新西蘭兔靜脈血在1 000 r/min下離心15 min后棄去上層血清和白細(xì)胞，下層紅細(xì)胞加入適量兔血紅細(xì)胞緩沖液充分混勻，再次離心棄上清。如此重復(fù)3次，最后用兔血紅細(xì)胞緩沖液配制成體積分?jǐn)?shù)為0.5%的兔血紅細(xì)胞溶液，儲存于4 ℃條件下備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藻種培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)濃度確定 實(shí)驗(yàn)用卵圓卡盾藻來自暨南大學(xué)赤潮與海洋生物學(xué)研究中心藻種室，分離自大亞灣。卵圓卡盾藻的培養(yǎng)采用人工海水[6]，用f/2培養(yǎng)基改良配方配制培養(yǎng)液，接種對數(shù)期的藻液后，置于溫度為25 ℃，光照強(qiáng)度為3 000 lx，光暗循環(huán) L∶D=12 h∶12 h的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，卵圓卡盾藻在經(jīng)人工海水培養(yǎng)馴化2代之后，當(dāng)銅和鎂金屬離子濃度為0.5倍f/2培養(yǎng)基(f/2培養(yǎng)基的銅離子濃度為9.80 μg/dm3，不添加鎂離子；鎂離子濃度為18.79 g/dm3，不添加銅離子)時即銅離子濃度為4.90 μg/dm3、鎂離子濃度為9.40 g/dm3時，只能維持生存而不出現(xiàn)增長現(xiàn)象，在不影響卵圓卡盾藻生長的基礎(chǔ)上，探討光合色素與溶血活性的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)金屬離子濃度如下：銅離子分別為3.92、5.88、7.84、9.80 μg/dm3，鎂離子分別為7.52、11.27、15.03、18.79 g/dm3，即0.4、0.6、0.8、1.0倍f/2培養(yǎng)基。

1.2.2 色素的提取與高效液相色譜檢測 色素提取參考Zapata等(1991)和Buffan-Dubau等(2000)的方法[7-8]。取50 cm3藻液進(jìn)行抽濾，將濾膜剪碎放入離心管中，加入3 cm3體積分?jǐn)?shù)為95%的甲醇在冰浴條件下超聲破碎8 min后3 000 r/min離心5 min，取離心后的上清液用針頭過濾器過濾2 cm3保存于-80 ℃條件下備用。

采用高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)對色素進(jìn)行分析，色譜柱為C8(150.0 nm×4.6 nm, 3.5 μm粒徑)，柱溫為25 ℃，流速為1 cm3/min，洗脫時間為45 min，DAD紫外檢測器的檢測波長為430、440、470 nm。流動相A為超純水，B為乙腈，C為甲醇-乙腈-丙酮(體積比為1∶1∶3)混合液，D為甲醇、乙腈-醋酸吡啶混合液。HPLC分析的進(jìn)樣量為100 mm3，為避免色素峰的變形，將200 mm3的提取液和67 mm3的超純水混合后立即進(jìn)樣，以防色素?fù)p失。每次分析時，用30 mm3混合色素標(biāo)準(zhǔn)液、90 mm3甲醇和40 mm3超純水混勻，作為標(biāo)準(zhǔn)工作液。以上所有的操作均在弱光環(huán)境下進(jìn)行，以免光照破壞色素。

1.2.3 溶血毒素的提取和溶血活性的檢測 溶血毒素的提取參照Eschbach等(2001)的方法[9]。取10 cm3藻液在11 000 r/min、4 ℃下離心15 min，棄上清液收集藻細(xì)胞，用1 cm3藻細(xì)胞毒素提取緩沖液重懸浮，在功率為30%的冰浴條件下超聲破碎1 min，即得溶血毒素提取液。取0.5%兔血紅細(xì)胞溶液200 cm3加入毒素提取液200 mm3。在25 ℃下反應(yīng)2 h。離心取上清液至96孔板，于414 nm波長下檢測其吸光值。溶血活性大小按下列公式計(jì)算：

(1)

式(1)中：H為溶血百分?jǐn)?shù)；As為相同體積的溶血毒素提取液與兔血紅細(xì)胞反應(yīng)后上清液的吸光值；Aa為陰性對照1，為同體積的提取溶血毒素的緩沖液與紅細(xì)胞置于相同條件的上清液吸光值；Ab為陰性對照2，為同體積的溶血毒素提取液與紅細(xì)胞緩沖液置于相同條件的上清液吸光值；Ac為陽性對照，為全溶紅細(xì)胞上清液的吸光值。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均為3個平行樣的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，組間差異通過SPSS 20.0軟件的單因素ANOVA統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 銅和鎂離子對卵圓卡盾藻生長的影響

從圖1(a)可以看出，卵圓卡盾藻在銅離子濃度為3.92～9.80 μg/dm3范圍內(nèi)，在培養(yǎng)的前8天，銅離子濃度對藻細(xì)胞密度無顯著影響。第8天后，銅離子濃度為3.92 μg/dm3時，卵圓卡盾藻到達(dá)最大藻密度(2.19×104個/cm3)后迅速進(jìn)入衰退期，且藻細(xì)胞密度低于9.80 μg/dm3組(2.87×104個/cm3)。但處于藻類指數(shù)生長期時的各組生長速率并無明顯差異。銅離子的添加對卵圓卡盾藻的生長至關(guān)重要，低濃度的銅離子會使卵圓卡盾藻提前進(jìn)入衰亡期。周海東等(2016)證明銅的缺失會干擾色素和脂質(zhì)的合成，銅有助于穩(wěn)定光系統(tǒng)PSII復(fù)合物附近的脂質(zhì)環(huán)境，是光合電子傳遞鏈中電子傳遞體質(zhì)藍(lán)素的重要元素之一[10]。但高濃度的銅也會抑制光合作用，Perales等(2007)的研究發(fā)現(xiàn)柵藻(Scenedesmusincrassatulus)對高濃度的銅離子更為敏感[11]。

如圖1(b)所示，在鎂離子濃度為7.52～18.79 g/dm3范圍內(nèi)，隨著鎂離子濃度的增加，卵圓卡盾藻的細(xì)胞密度也逐漸增加。鎂離子濃度為7.52 g/dm3時，卵圓卡盾藻的細(xì)胞密度最低，且在培養(yǎng)的第10天進(jìn)入衰亡期。Urek等(2019)研究表明鈍頂節(jié)旋藻(Arthrospiraplatensis)在鎂離子不足的條件下生物量降低[12]，說明低濃度的鎂離子不利于藻類的生長。Hoyoung等(2019)研究不同濃度的鎂離子在低光條件下對銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)的生長影響表明，一定濃度的鎂離子促進(jìn)了銅綠微囊藻的細(xì)胞分裂[13]，本研究也發(fā)現(xiàn)高濃度組鎂離子的最大細(xì)胞密度明顯高于其他組。

圖1 不同濃度的銅和鎂離子對卵圓卡盾藻生長的影響

2.2 銅和鎂離子對卵圓卡盾藻光合色素含量的影響

高效液相色譜分析顯示，卵圓卡盾藻的主要光合色素成分包括Mg-2, 4-二乙烯基脫鎂卟啉a5單甲基酯(MgDVP)、葉綠素c2、硅甲藻黃素、紫黃質(zhì)、巖藻黃素和葉綠素a。

在藻類光合系統(tǒng)中，銅離子主要作為光化學(xué)系統(tǒng)PSⅡ上電子供體輔基的超氧化物歧化酶參與電子傳遞，同時也會參與葉綠體光合膜脂的合成[14]。Rodríguez等(2018)研究發(fā)現(xiàn)低濃度的銅離子可誘導(dǎo)藻類的光合作用和類胡蘿卜素水平的增加，而當(dāng)銅離子濃度高于最佳水平時也會干擾各種代謝途徑，從而抑制光合作用[15]。在本研究中，銅離子濃度范圍為3.92～9.80 μg/dm3(圖2)，卵圓卡盾藻單位藻細(xì)胞的MgDVP和葉綠素c2平均含量隨濃度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，高濃度和低濃度組的MgDVP平均含量變化顯著(p<0.05)，其中當(dāng)銅離子濃度為7.84 μg/dm3時，MgDVP和葉綠素c2平均含量最高。巖藻黃素和硅甲藻黃素的平均含量總體上隨著銅離子的濃度增加呈現(xiàn)減少的趨勢，組間差異顯著(p<0.05)，高濃度的銅離子可能抑制了這兩種色素的積累。而隨著銅離子濃度的增加，葉綠素a的平均含量變化不顯著(p>0.05)，表明在銅離子濃度為3.92～9.80 μg/dm3的范圍內(nèi)，卵圓卡盾藻的其他光合色素比葉綠素a對銅離子更為敏感。而郭宏實(shí)等(2019)研究發(fā)現(xiàn)，杜氏鹽藻(Dunaliellasalina)的葉綠素a比類胡蘿卜素對銅離子敏感[16]，可能不同的藻類對銅離子的激性響應(yīng)不同。

圖2 不同濃度的銅離子對卵圓卡盾藻光合色素含量的影響

鎂是藻類光合作用的重要元素之一，除了作為多種酶的活化劑參與光合作用之外，鎂直接參與葉綠素的合成，是葉綠素中心原子的重要組成，保持天線色素、反應(yīng)中心及電子載體間的聯(lián)系，促進(jìn)光能被高效的吸收、轉(zhuǎn)化和傳遞[13]。另外，適當(dāng)?shù)逆V也促進(jìn)類胡蘿卜素的合成[14]。在鎂離子濃度為7.52～18.79 g/dm3的范圍內(nèi)(圖3)，卵圓卡盾藻單位藻細(xì)胞的MgDVP和葉綠素a的平均含量總體上隨著鎂離子濃度的增加而減少，高濃度組與低濃度組鎂離子平均含量的差異顯著(p<0.05)，說明高濃度的鎂離子抑制了MgDVP和葉綠素a的合成；Urek等也發(fā)現(xiàn)鈍頂節(jié)旋藻(Arthrospiraplatensis)在較高鎂離子的條件下葉綠素含量會降低[12]。隨著鎂離子濃度的增加，葉綠素c2和硅甲藻黃素的平均含量總體上增加，高濃度組與低濃度組相比差異顯著(p<0.05)，而紫黃質(zhì)、巖藻黃素平均含量變化不顯著(p>0.05)。

圖3 不同濃度的鎂離子對卵圓卡盾藻光合色素含量的影響

2.3 銅和鎂離子對卵圓卡盾藻溶血活性的影響

溶血毒素是魚毒性藻類產(chǎn)生的一種可致使動物血紅細(xì)胞破損的次生代謝產(chǎn)物[17]，其產(chǎn)生受多種環(huán)境因素的影響。本研究結(jié)果顯示(圖4)，銅和鎂離子濃度分別為3.92～9.80 μg/dm3和7.52～18.79 g/dm3時，卵圓卡盾藻的溶血活性隨著離子濃度增加而增加，銅離子和鎂離子在高濃度和低濃度時的溶血活性差異顯著(p<0.05)。宋秀凱等(2006)也發(fā)現(xiàn)一定濃度的鎂離子能夠顯著增加多變魚腥藻(Anabaenavariabilis)的溶血活性[18]，說明不同金屬離子對藻類的溶血活性存在著顯著的影響，但其中的機(jī)制仍然不清楚。

圖4 不同濃度的銅和鎂離子對卵圓卡盾藻溶血活性的影響

2.4 卵圓卡盾藻的溶血活性與光合色素的關(guān)系

為了進(jìn)一步證明溶血活性與光合色素的關(guān)系，對不同濃度銅離子和鎂離子條件下的卵圓卡盾藻6種主要色素MgDVP、葉綠素c2、巖藻黃素、紫黃質(zhì)、硅甲藻黃素和葉綠素a與溶血活性進(jìn)行因子分析，結(jié)果如圖5所示。卵圓卡盾藻溶血活性與葉綠素c2在因子1上載荷較高，因子1主要由溶血活性和葉綠素c2決定。因此，相比于其它光合色素卵圓卡盾藻的溶血活性與葉綠素c2關(guān)系密切，溶血毒素可能是葉綠素c2的類似物。目前，已知的魚毒性藻類溶血毒素組分主要有卟啉類、不飽和脂肪酸類、糖脂類及脂肪酸酰胺類類似物。就毒素成分與光合色素而言，Kuroda等(2005)研究表明，純化的海洋卡盾藻(Chattonellamarina)溶血毒素與葉綠素c在446、583、635 nm處的吸收峰極為相似，可能是葉綠素c的衍生物[19]。Miyazaki等(2005)對褐藻Eiseniabicyclis的提取物分析表明其溶血毒素是含有吡咯環(huán)的卟啉衍生物，其結(jié)構(gòu)與脫鎂葉綠酸甲酯類似[20]，還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)許多葉綠素的衍生物或卟啉類物質(zhì)都是光活毒素，如Henrikson等(2010)從環(huán)狀異帽藻(Heterocapsacircularisquama)中提取的葉綠素c2 類似物就具有一定的細(xì)胞毒性[21]。赤潮異彎藻(Heterosigmaakashiwo)和海洋卡盾藻的溶血毒素提取物也具有光依賴性[22]。除卟啉衍生物外，由糖脂類和多不飽和脂肪酸類組成的溶血毒素也可能作為光合作用的產(chǎn)物。糖脂是含有糖基的脂質(zhì)，是藻類光合作用的次級產(chǎn)物，也是植物光合膜脂的主要成分，受光合作用調(diào)控。在光合作用(PS II)階段，可能作為電子的供體或受體存在[23]。有學(xué)者證實(shí)小定鞭藻(Prymnesiumparvum)溶血毒素為糖脂類化合物，海洋卡盾藻的溶血毒素是糖脂類和多不飽和脂肪酸類；針胞藻(Fibrocapsajaponica)產(chǎn)生的4種多不飽和脂肪酸均具有溶血活性[24]。

圖5 卵圓卡盾藻的溶血活性與光合色素的關(guān)系

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度的鎂離子對卵圓卡盾藻的溶血活性和葉綠素c2含量的影響趨勢變化一致， 且組間差異顯著，可能鎂離子通過參與葉綠素c衍生物的合成來影響溶血活性，卵圓卡盾藻的溶血毒素很可能就是葉綠素c2或其類似物。而不同濃度的銅離子可能是通過調(diào)控多不飽和脂肪酸的合成，參與光合膜脂的合成顯著影響其溶血活性。對比不同金屬離子濃度下的光合色素及溶血毒素的變化可以發(fā)現(xiàn)，魚毒性藻類卵圓卡盾藻的溶血毒素與藻類的光合作用系統(tǒng)直接相關(guān)，提示溶血毒素可能就是藻細(xì)胞葉綠素及其衍生物或參與光合作用的代謝產(chǎn)物。

3 結(jié)論

(1)銅和鎂離子均會對卵圓卡盾藻的生長、光合色素以及溶血毒素產(chǎn)生影響。隨著銅和鎂離子濃度的增加，卵圓卡盾藻的細(xì)胞密度增加，低濃度銅和鎂離子對藻類生長有一定限制作用。高濃度的銅離子可能抑制卵圓卡盾藻的巖藻黃質(zhì)和硅甲藻黃素的積累，鎂離子濃度增加，葉綠素c2和硅甲藻黃素會隨之增加。高濃度的銅離子及鎂離子也會使卵圓卡盾藻的溶血活性增加，說明過量或不足的金屬離子均可能影響藻類的生長、光合色素以及溶血毒素的合成。

(2)不同濃度的鎂離子對卵圓卡盾藻的溶血活性和葉綠素c2含量的影響趨勢變化一致；卵圓卡盾藻的葉綠素與溶血活性因子分析進(jìn)一步提示其溶血活性和葉綠素c2關(guān)系密切，溶血毒素可能是葉綠素c2或其類似物。