魏祖晨，趙順鑫，李卓蔚，周 濃，黃小蘭，郭冬琴，趙晶晶

(重慶三峽學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，三峽庫區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實(shí)驗(yàn)室，重慶 404120)

木香(AucklandialappaDecne)是菊科植物云木香和川木香的通稱，又名蜜香、廣木香、青木香。常以其根入藥，具有健胃消脹以及行氣止痛之功效，可治療胸腹脹痛、停食積聚、嘔吐瀉痢等病癥[1]。木香有效成分集中表現(xiàn)在其揮發(fā)油上，以最為豐富的木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯作為主要活性成分，具有良好的消炎和抗腫瘤功效[2]。據(jù)考證，歷史上木香來源復(fù)雜，其產(chǎn)地幾經(jīng)變遷，現(xiàn)主要集中于云貴川地區(qū)[3-4]。我國(guó)野生木香資源曾經(jīng)十分豐富，但近些年由于木香激增的市場(chǎng)價(jià)值與市場(chǎng)需求，人們開始對(duì)木香進(jìn)行瘋狂的采挖砍伐，導(dǎo)致其野生資源幾近枯竭。因此，尋找合適的木香人工育苗方法顯得尤為重要，利用現(xiàn)代技術(shù)提高木香產(chǎn)量與品質(zhì)亦成為了當(dāng)前研究的重點(diǎn)[5-6]。

叢枝菌根(AM)真菌能與80%以上的高等植物根系形成良好的共生，改善宿主植物的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)[7]，提高其適應(yīng)性和抗逆能力[8]。有研究表明，接種AM真菌能增加西瓜土壤的肥力[9]。尤其在非生物脅迫作用情況下，AM真菌能使共生植株的生長(zhǎng)發(fā)育得到明顯改善[10]。另有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，木香接種AM真菌能夠促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育和生物活性成分的累積[11]?？梢?，AM真菌在維護(hù)植物健康，增強(qiáng)其抗病能力方面具有重要作用[12-13]。因此，AM真菌在中藥材栽培方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

近年來，不斷有學(xué)者將AM真菌運(yùn)用于經(jīng)濟(jì)植物的共生栽培中，如AM真菌能有效降低人工栽培滇重樓中重金屬元素的含量[14]，并且能有效修復(fù)Cd和Pb復(fù)合污染的土壤，提高植物對(duì)重金屬的耐受能力[15]。因此將AM真菌接種于木香，培育后測(cè)定其無機(jī)元素含量，探究AM真菌是否能在木香中發(fā)揮同樣的作用，對(duì)木香今后的栽培地選擇及品質(zhì)優(yōu)化提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

ME204E型萬分之一分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；Speedwave Xpert型微波消解系統(tǒng)(北京利曼科技有限公司)；AFS-9750原子熒光光度計(jì)(北京海光儀器有限公司)；TAS-990AFG型原子吸收分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 試劑

單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL)：Cu(批號(hào)GSB 04-1725-2004)、Hg(批號(hào)GSB 04-1729-2004)、Mg(批號(hào)GSB 04-1735-2004)、Na(批號(hào)GSB 04-1738-2004)、Ca(批號(hào)GSB 04-1720-2004)、As(批號(hào)GSB 04-1714-2004)、Cr(批號(hào)GSB 04-1723-2004)、Zn(批號(hào)GSB 04-1761-2004)、Cd(批號(hào)GSB 04-1721-2004)、Mn(批號(hào)GSB 04-1736-2004)、P(批號(hào)GSB 04-1741-2004a)、K(批號(hào)GSB 04-1733-2004)、Pb(批號(hào)GSB 04-1742-2004)、Ni(批號(hào)GSB 04-1740-2004)、Cr(批號(hào)GSB 04-1723-2004a)均購自國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心；硝酸、高氯酸、氫氟酸均為優(yōu)級(jí)純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；水為去離子水。木香對(duì)照藥材(批號(hào)為120921-201309)購買于中國(guó)食品藥品檢定研究院，編為DZ組，見表1。

1.3 AM真菌

通過美利堅(jiān)共和國(guó)國(guó)際叢枝菌根真菌種質(zhì)資源保藏中心(INVAM)購得相應(yīng)的AM真菌純凈菌劑，并經(jīng)重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院郭冬琴副教授進(jìn)行鑒定，作為本研究供試菌株，詳細(xì)見表1。

表1 不同處理組及其接種AM真菌Table 1 Different treatment groups and inoculated AM fungi

1.4 木香種子

2012年10月，課題組在位于重慶市開縣河堰鎮(zhèn)的木香種植基地，選取株高、株型一致的健壯植株，采其成熟、新鮮的種子，并經(jīng)重慶三峽學(xué)院周濃教授鑒定為菊科植物木香A.lappa。

1.5 接種處理及栽培管理

栽培容器為15 cm×18 cm的棕色塑料花盆(用酒精擦拭3遍后用)，栽培介質(zhì)為園土和河沙按3∶1體積比混合制成，并過10目(2 mm)篩，在121℃滅菌2 h，每盆裝土量為16.0 kg。試驗(yàn)地點(diǎn)為重慶市萬州區(qū)鐵峰山國(guó)家森林公園室內(nèi)，試驗(yàn)時(shí)間為2013年2月～2014年12月。

試驗(yàn)共設(shè)置25個(gè)處理組，設(shè)24組AM真菌處理組(育苗時(shí)單一接種AM真菌)和CK(對(duì)照)組(幼苗生長(zhǎng)過程中不接種AM真菌)，每處理組10個(gè)重復(fù)，每盆播種木香種子20粒，出苗后間苗5株。AM真菌菌土均勻施于木香種子(10%次氯酸鈉溶液消毒15 min，清水沖洗干凈)的表土下，接種劑量為每盆300個(gè)孢子(接菌體帶有孢子、菌絲及侵染后根系的栽培基質(zhì))，同時(shí)播種紫云英(10%次氯酸鈉溶液消毒15 min，清水沖洗干凈)混合培養(yǎng)，待木香幼苗出土后除去紫云英植株。CK組不接種AM真菌，其他處理與處理組一致。將盆栽放置于室溫(自然光照)下，定期觀察與分析，按照木香的常規(guī)養(yǎng)護(hù)方法管理，每周澆1次Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。

1.6 樣品采集與指標(biāo)測(cè)定

1.6.1 樣品

于2014年7月選擇完整無損、長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)良并健康的木香根部洗凈、烘干，按分析要求分別粉碎過篩(40目)，備用。

1.6.2 元素測(cè)定

木香樣品中的N含量采用凱氏蒸餾法進(jìn)行測(cè)定[16]，P含量采用釩鉬黃比色法進(jìn)行測(cè)定[17]。K、Ca、Mg、Na、Mn、Zn、Cu、Ni、Cd、Cr和Pb含量采用原子吸收分光光度法進(jìn)行測(cè)定[18]，即稱取木香0.200 0 g于消解管中，加入8 mL硝酸，在微波消解儀上進(jìn)行消解(190℃，10 min)，消解完全后，冷卻轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用1%硝酸溶液定容至刻度，空白樣品同處理。Hg和As含量采用原子熒光分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定[19]，即稱取木香樣品0.200 0 g于消解管中，在微波消解儀上進(jìn)行消解，消解完全后，Hg測(cè)定時(shí)，無需揮發(fā)掉酸，直接轉(zhuǎn)移定容至25 mL測(cè)定；As測(cè)定時(shí)，加入5%硫脲、5%抗壞血酸和50%鹽酸各2.5 mL，定容至25 mL后反應(yīng)30 min。空白樣品同處理。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)的錄入、整理，用 SPSS 19.0做方差分析，用Origin 9.1軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同AM真菌處理對(duì)木香大量元素含量的影響

24種AM真菌處理對(duì)木香大量元素的影響結(jié)果如表2所示，不同AM真菌處理對(duì)木香大量元素(N、P、K、Ca、Mg)含量的影響存在顯著差異(P<0.05)。其中，24種真菌處理后的木香與CK組相比，60%以上的AM真菌處理組中N元素含量呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，其中Svi處理組含量最高為55.312 mg/g，是CK組的2倍以上，表明外源接種Svi處理組的AM真菌有利于木香根部對(duì)N元素的吸收；同時(shí)Gr、Sc、Ds、Sp、Afo、Asc、Rc、Rf、Ri這9個(gè)處理組N含量有所下降，最低的Rc處理組含量為13.271 mg/g，僅為CK組的50%左右，下降幅度較大。相反，60%的處理組中P元素含量出現(xiàn)下降現(xiàn)象，Po處理組含量為0.624 mg/g，與CK組相比，下降了80%左右；而Svi處理組對(duì)P元素的影響同N，提高到7.235 mg/g。同時(shí)，僅有25%的AM真菌處理組中K元素含量有所下降，其余處理組均呈上升趨勢(shì)。Ds處理組含量最高，是CK組的3倍以上，達(dá)到27.009 mg/g，表明Ds處理組的AM真菌有利于木香根部對(duì)K元素的吸收。相反，80%的AM真菌處理組中，Ca元素含量都普遍呈下降趨勢(shì)。其中最低的Ga處理組含量為0.070 mg/g，不足CK組的百分之一。同樣，24個(gè)木香處理組中，80%以上的處理組中Mg元素含量呈現(xiàn)下降，最高Al處理組與最低Fm處理組含量相差達(dá)10 mg/g以上，這說明僅有少數(shù)AM真菌可以促進(jìn)木香根部對(duì)Mg元素的吸收。從大量元素含量增長(zhǎng)率來看，外源接種Gg、Rc和Al三個(gè)AM真菌可以顯著促進(jìn)木香根系對(duì)大量元素的吸收，而Svi、Asp和Pb處理的調(diào)控效果次之，其余處理對(duì)大量元素吸收的促進(jìn)效果較差。

表2 不同AM真菌處理后木香根部大量元素含量Table 2 Contents of macronutrients in roots of A. lappa treated with different AM fungi (mg/g)

2.2 不同AM真菌處理對(duì)木香微量元素含量的影響

24種AM真菌處理對(duì)木香微量元素的影響結(jié)果如表3所示，不同AM真菌處理對(duì)木香微量元素(Mn、Zn、Cr、Na、Ni)含量的影響存在顯著差異(P<0.05)。其中，24種AM真菌處理后的木香與CK組相比，75%的AM真菌處理組中Mn含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，含量最高的Po處理組與最低的Fm處理組相差達(dá)50倍以上，這說明AM真菌處理后木香對(duì)Mn元素的吸收存在極顯著差異。同時(shí)60%以上的AM真菌處理組中Zn元素含量也出現(xiàn)了下降趨勢(shì)，但含量最高的Po處理組為0.527 mg/g，僅為CK的2倍，可見AM真菌處理前后，木香對(duì)Zn的吸收差異不大。相反，50%以上的AM真菌處理組中Cr元素含量都呈上升趨勢(shì)，其中Gd處理組含量最高為0.110 mg/kg，表明Gd處理組AM真菌處理有利于Cr的吸收。然而，超過75%的處理組中Na元素含量出現(xiàn)了下降趨勢(shì)，但Svi處理組含量最高為10.983 mg/g，是最低組的10倍，CK組的2倍，這說明AM真菌處理對(duì)木香吸收Na能力影響顯著。同時(shí)75%的處理組中Ni元素含量出現(xiàn)下降趨勢(shì)，但最高的Sp處理組含量達(dá)到54.492 mg/kg，遠(yuǎn)大于最低的Fm組和CK組，這說明AM真菌處理對(duì)木香吸收Ni元素能力影響極顯著。從微量元素含量增長(zhǎng)率來看，外源接種Gd、Ec、Po和Al四個(gè)AM真菌可以顯著促進(jìn)木香根系對(duì)微量元素的吸收，而Ga、Afo和Rc處理的調(diào)控效果次之，其余處理對(duì)微量元素吸收的促進(jìn)效果較差。

表3 不同AM真菌處理后木香根部微量元素含量Table 3 Contents of trace elements in roots of A. lappa treated by different AM fungi (mg/kg)

2.3 不同AM真菌處理對(duì)木香有害元素含量的影響

24種AM真菌處理對(duì)木香有害元素的影響結(jié)果如表4所示，共檢測(cè)了Cd、Cu、Hg、Pb、As五種有害元素。經(jīng)處理分析，不同AM真菌處理對(duì)木香有害元素含量的影響存在顯著差異(P<0.05)。其中，Hg、Cd檢出率較低。參照WM/T2-2004《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》，即Pb≤ 5.0 mg/kg，Cd≤ 0.3 mg/kg，As≤ 2.0 mg/kg，Hg≤ 0.2 mg/kg，Cu≤ 20 mg/kg。檢出的五種有害元素中，Ga、Svi、Po、DZ處理組中As出現(xiàn)超標(biāo)，其余四種元素大大低于此標(biāo)準(zhǔn)。與CK處理組相比，大部分處理組有害元素含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，AM真菌處理能有效降低木香根部對(duì)有害元素的吸收。其中，Gm、Sc和Sp處理組的調(diào)控效果最佳，Ga、Gg、Sdi、Sd、Fm、Asc和Pb處理組的效果次之。

表4 不同AM真菌處理后木香根部有害元素含量Table 4 Contents of harmful elements in roots of A. lappa treated with different AM fungi (mg/kg)

2.4 不同AM真菌處理木香元素間相關(guān)性分析

木香常以其根入藥，本文測(cè)定樣品為不同AM真菌處理組的木香根。利用SPSS對(duì)24組不同AM真菌處理木香根中的15種元素進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表5所示，不同AM真菌處理后的木香部分元素間存在一定相關(guān)性。其中，有17對(duì)元素呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，包括N-P、P-Hg、K-Mg，Ca與Mn、Pb、Cu、Zn，Na與Cr、As，Mn與Pb、Cu、Zn，Cr與As等，這說明木香部分元素間存在相互促進(jìn)累積的作用。

表5 不同AM真菌處理后木香根部元素相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis of elements in roots of A. lappa treated with different AM fungi

3 討 論

木香作為一種中藥材，因其具有健胃消脹以及行氣止痛之功效而受到了廣泛的關(guān)注。AM真菌作為陸地生態(tài)系統(tǒng)廣譜有益的微生物，可與80%以上的高等植物根系形成互惠的共生體[20]，因其能促進(jìn)宿主的生長(zhǎng)發(fā)育、增強(qiáng)其抗逆性，在中藥材的培育中前景廣闊。近年來，科研工作者對(duì)木香與AM真菌接種的研究也逐步深入，陽文武等[6]通過測(cè)定云木香幼苗的根系菌根侵染率、根生物量、生理生化特性及萜類成分積累等指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)美麗盾巨孢囊霉(Scutellosporacalospora，Sca)、易誤巨孢囊霉(Gigasporadecipiens，Gd)、沙荒球囊霉(Septoglomusdeserticola，Sde)、瑚狀盾巨囊霉(Racocetracoralloidea，Rco)、巴西類球囊霉(Paraglomusbrasilianum，Pb)和哥倫比亞內(nèi)養(yǎng)囊霉(Entrophosporacolombiana，Ec)可以作為人工云木香栽培條件下的潛在優(yōu)良菌株進(jìn)行施用。微量元素與中藥藥效及藥性的關(guān)系長(zhǎng)期以來都受到人們的關(guān)注。中藥中的微量元素進(jìn)入人體后，有可能促進(jìn)中藥中某些藥用成分發(fā)揮作用，并且某些微量元素本身就有療效作用，如Na、K和Ca可以維持體內(nèi)細(xì)胞的內(nèi)外滲透平衡，維持神經(jīng)細(xì)胞膜的生物興奮性；Zn可以增強(qiáng)人體的免疫功能；Mn可以減少血管內(nèi)血栓的形成，降低動(dòng)脈硬化的危險(xiǎn)；Mg是多種酶的輔基和激活劑[21]。本文將24種AM真菌接種于木香植株，探究其根部?jī)?nèi)各元素含量的變化情況，發(fā)現(xiàn)大部分處理組的木香根部?jī)?nèi)大量元素和微量元素含量遠(yuǎn)超過CK組，而有害元素含量則顯著低于CK組，這證明外源接種AM真菌對(duì)木香根部無機(jī)元素的吸收起到了促進(jìn)作用。根據(jù)木香根部對(duì)無機(jī)元素的吸收情況來看，Al、Rc、Ga、Gg和Pb處理組對(duì)木香根部無機(jī)元素吸收的調(diào)控效果最佳，在木香生產(chǎn)栽培上可以進(jìn)行施用。

將這些無機(jī)元素用SPSS進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，部分元素含量之間存在極顯著或顯著相關(guān)關(guān)系。AM真菌與植物根部形成的共生系統(tǒng)，增強(qiáng)了植物的富集能力，但不同真菌或不同植物之間的相互作用，最適條件仍值得繼續(xù)探究?？傮w來看，接種AM真菌對(duì)木香無機(jī)元素吸收是存在影響的。這些影響既有拮抗作用又有協(xié)同作用。本研究為木香今后研究奠定了基礎(chǔ)，為木香未來發(fā)展拓展了空間，也填補(bǔ)了AM真菌在中藥材應(yīng)用中的空白。