王向英 ，高建華 ，孟會(huì)生 ，張 杰 ，武 欣 ，洪堅(jiān)平

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，山西太谷030801）

山西是煤炭大省，煤炭開采和復(fù)墾過程中的工程措施都會(huì)對土壤造成擾動(dòng)，導(dǎo)致重構(gòu)（復(fù)墾）土壤生產(chǎn)力低下，養(yǎng)分極度缺乏[1]。復(fù)墾土壤常因缺磷使固氮效率很低，磷素已成為限制礦區(qū)復(fù)墾土壤養(yǎng)分提升的主要因子[2-3]，施用的磷肥也常因土壤的固定作用而效果不佳[4]。解磷微生物可將土壤中的難溶磷（有機(jī)磷或無機(jī)磷）轉(zhuǎn)化為植物可利用的有效磷[5-6]。一些解磷菌還可以固氮，產(chǎn)生吲哚乙酸（IAA）、鐵載體來促進(jìn)植物生長[7-9]。因此，施用解磷微生物對復(fù)墾土壤中磷素活化以及促進(jìn)植物對氮、磷的吸收具有積極作用。CHEN 等[10]從山西復(fù)墾土壤中篩選得到解磷菌S32，該菌株對難溶磷有較高的溶解能力，可明顯提高復(fù)墾土壤中有效磷含量，顯著提高水稻的株高、生物量、根系生長和磷的吸收。栗麗等[11]研究發(fā)現(xiàn)，與未接種解磷菌的處理相比，解磷菌能夠促進(jìn)磷礦粉和磷酸鈣在復(fù)墾土壤中磷的生物有效性，提高盆栽油菜對磷的吸收。喬志偉等[12]研究表明，復(fù)墾土壤中施用解磷菌，可以改善土壤磷素的解吸特征，有利于土壤快速培肥，增加作物產(chǎn)量。孟會(huì)生等[13]研究表明，解磷菌肥與有機(jī)無機(jī)肥配施能夠提高復(fù)墾土壤有效磷含量及堿性磷酸酶活性，促進(jìn)土壤微生物群落多樣性恢復(fù)，進(jìn)而改善復(fù)墾土壤結(jié)構(gòu)和肥力。

為準(zhǔn)確回收投放到環(huán)境中的功能微生物，檢測微生物在植物根際和土壤中的定殖情況，首先要對微生物進(jìn)行標(biāo)記。在諸多標(biāo)記法中，綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記因具有基因小、靈敏度高、穩(wěn)定性好、可以實(shí)時(shí)原位監(jiān)測等優(yōu)點(diǎn)，在研究微生物與環(huán)境、宿主相互作用，基因表達(dá)調(diào)控等方面得到廣泛的應(yīng)用[14-15]，是目前理想的報(bào)告基因。但在實(shí)踐中常出現(xiàn)解磷微生物田間作用效果不穩(wěn)定的現(xiàn)象，制約了解磷菌肥的推廣使用[5]。施用到土壤中的解磷微生物首先能夠在土壤或植物根際有效定殖，才能發(fā)揮其解磷功能[16]。因此，研究解磷微生物在土壤及植物根際的定殖能力，對闡明其在土壤中的實(shí)際解磷效果具有重要意義。

本研究將含有GFP 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入前期分離的解磷菌w134 和w137 中，通過測定標(biāo)記前后菌體的生長曲線和解磷能力變化來評估GFP 標(biāo)記對菌株的影響，并初步研究其在復(fù)墾土壤中的定殖能力，為后期研究其在復(fù)墾土壤中的實(shí)際應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

解磷菌w134 和w137 分離自山西襄垣的礦區(qū)土壤，經(jīng)鑒定2 株菌均為熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescence）。質(zhì)粒 pRTGFP 為組成型 GFP基因（1.4 kb）克隆到廣宿主載體pTR102 上，具有氨芐青霉素（Amp）和四環(huán)素（Tet）抗性，保存在大腸桿菌DH5α 中，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)鐘增濤教授惠贈(zèng)。試驗(yàn)所用抗生素購自北京索萊寶科技有限公司。內(nèi)切酶KpnⅠ和BglⅡ購自紐英倫生物技術(shù)（北京）有限公司（NewEngland Biolabs）。

含GFP 質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α 與解磷菌w134和 w137 均采用 LB 培養(yǎng)基，分別在 37、30 ℃條件下培養(yǎng)。測定w134 和w137 解磷能力時(shí)采用NBRIP培養(yǎng)基，配方為：葡萄糖10 g、Ca（3PO4）25 g、MgCl·22H2O 5 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、KCl 0.2 g、（NH4）2SO40.1 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 值為 7.0。

定殖試驗(yàn)的土壤取自山西襄垣采煤塌陷區(qū)生土，土壤類型為石灰性褐土，取回的土壤風(fēng)干后過2 mm 篩，備用。有機(jī)肥為腐熟雞糞，購自太谷鴻昊養(yǎng)殖場。

1.2 方法

1.2.1 GFP 標(biāo)記菌株構(gòu)建 將含GFP 質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α 活化，挑取單菌落于3 mL 含有Amp 50 μg/mL 和 Tet 50 μg/mL 的 LB 培養(yǎng)液中，37 ℃，180 r/min 過夜培養(yǎng)。按照質(zhì)粒提取說明書（TIANGEN）步驟提取質(zhì)粒，1%的瓊脂糖凝膠電泳，Nanodrop 2000 測定質(zhì)粒濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

w134 和w137 的感受態(tài)制備和高壓電擊轉(zhuǎn)化按照李曉婷[16]的方法進(jìn)行；電擊后迅速加入800 μL的 LB 培養(yǎng)液，30 ℃、100 r/min 培養(yǎng) 2 h；隨后取100 μL 培養(yǎng)液涂布到含有 Amp 50 μg/mL 和 Tet 50 μg/mL 的 LB 平板上，30 ℃培養(yǎng)，觀察是否有轉(zhuǎn)化子長出；從有轉(zhuǎn)化子長出的平板上隨機(jī)挑取單菌落，接入含有相應(yīng)抗生素濃度的LB 液體中，30 ℃、180 r/min 培養(yǎng)過夜；在熒光顯微鏡（OLYMPUS）下觀察菌株是否有綠色熒光，并提取質(zhì)粒。配置30 μL的酶切體系：10×Buffer 3 μL、酶BglⅡ0.5 μL、酶KpnⅠ0.5 μL、質(zhì)粒 DNA 26.0 μL，置于 37 ℃，水浴30 min，后用1%的瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.2 標(biāo)記菌株的穩(wěn)定性檢測 在非選擇壓力下檢測標(biāo)記菌的穩(wěn)定性[17]。用不含抗生素的LB 液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，對GFP 標(biāo)記菌株在指數(shù)期以1%的接種量連續(xù)轉(zhuǎn)接15 代，相當(dāng)于連續(xù)平板傳代培養(yǎng)100 代[18]；后蘸取第15 代培養(yǎng)的菌液在含有抗生素的LB 平板上劃線，挑取單菌落，小搖，提質(zhì)粒。并且在熒光顯微鏡下觀察菌株是否還有綠色熒光。

1.2.3 標(biāo)記前后菌株生長曲線比較 分別挑取野生菌和GFP 標(biāo)記菌的單菌落于3 mL LB 中培養(yǎng)，當(dāng)OD600值約0.5 時(shí)，按1%接種量接入含100 mL LB的三角瓶中，3 次重復(fù)，30 ℃、180 r/min 連續(xù)培養(yǎng)，每1 h 取樣一次，于600 nm 下測定其OD 值。

1.2.4 標(biāo)記前后菌株解磷能力比較 平板測定：將野生菌和GFP 標(biāo)記菌分別點(diǎn)種在NBRIP 固體平板上，30 ℃培養(yǎng)7 d，測定菌落直徑和透明圈直徑，計(jì)算透明圈與菌落直徑比。

液體培養(yǎng)測定：按1%的接種量接入NBRIP 液體培養(yǎng)基中，設(shè) 3 個(gè)重復(fù)，30 ℃、180 r/min 培養(yǎng) 7 d；每天取樣5 mL，于10 000 r/min 離心 10 min，用鉬藍(lán)比色法測定上清液中有效磷含量。

1.2.5 標(biāo)記菌株在復(fù)墾土壤中的定殖 將標(biāo)記菌w134GFP、w137GFP 分別接入復(fù)墾土壤中，試驗(yàn)設(shè)未滅菌土壤（N）、未滅菌土壤+有機(jī)肥（NM）、滅菌土壤（S）、滅菌土壤＋有機(jī)肥（SM）共 4 個(gè)處理，觀察菌株在90 d 內(nèi)的定殖動(dòng)態(tài)以及土壤滅菌和施加肥料對定殖的影響（表1）。每盆裝650 g 土，按照5%（V/m）的接種量接入標(biāo)記菌的菌懸液（1.0×109cfu/mL），土壤中菌體的初始含量為5.0×107cfu/g，每處理3 個(gè)重復(fù)。前42 d 每7 d 進(jìn)行一次涂板計(jì)數(shù)，之后每10 d 進(jìn)行一次涂板計(jì)數(shù)，期間保持土壤含水量在12%左右。

表1 標(biāo)記菌在復(fù)墾土壤中定殖試驗(yàn)設(shè)計(jì)

每次涂板計(jì)數(shù)之前將盆中的土混合均勻，每盆取10 g 土，按照平板稀釋涂布法，涂布于含Amp 50 mg/L 和 Tet 50 mg/L 的 LB 平板上，30 ℃培養(yǎng)36～48 h，觀察計(jì)數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)和圖表處理；方差分析利用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 GFP 標(biāo)記菌株的構(gòu)建與檢測鑒定

野生菌w134 和w137 均不能在Amp 50 mg/L和Tet 50 mg/L 的雙抗平板上生長，而GFP 質(zhì)粒具有Amp 和Tet 抗性，電擊轉(zhuǎn)化后能在LB 雙抗平板上生長的菌落即為轉(zhuǎn)化子，記為w134GFP 和w137GFP。熒光顯微鏡中可以觀察到轉(zhuǎn)化子都帶有強(qiáng)烈的綠色熒光（圖1-A），說明質(zhì)粒pTRGFP 已分別轉(zhuǎn)入w134 和w137 中且GFP 基因成功表達(dá)。提質(zhì)粒酶切后的條帶如圖1-B 所示，與大腸桿菌DH5α的GFP 質(zhì)粒酶切后的條帶相同，且都有一個(gè)大約1.4 kb 的條帶，與組成型的GFP 大小一致，再次證明GFP 質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入w134 和w137 中。

2.2 標(biāo)記菌的穩(wěn)定性試驗(yàn)

在不加抗生素的條件下，將連續(xù)傳代培養(yǎng)15 代后的w134GFP 和w137GFP 進(jìn)行熒光檢測和質(zhì)粒提取，仍可以看見強(qiáng)烈的綠色熒光，并提取出相應(yīng)的質(zhì)粒。說明GFP 質(zhì)粒在w134GFP 和w137GFP 傳代過程中可穩(wěn)定表達(dá)，可進(jìn)行后續(xù)的定殖試驗(yàn)。

2.3 GFP 標(biāo)記前后菌株生長情況比較

由圖 2 可知，2 株解磷菌 w134 和 w137 在 GFP標(biāo)記前后的生長曲線基本一致，0～2 h 為延遲期，2～8 h 是對數(shù)生長期，8 h 后進(jìn)入穩(wěn)定期。值得注意的是，w134GFP 的 OD 值在前 8 h 內(nèi)略低于 w134，w137GFP 的OD 值在前7 h 內(nèi)略低于w137?？梢?，GFP 標(biāo)記對解磷菌的生長速度略有影響，但均未影響2 個(gè)菌株最終的生長量。

2.4 GFP 標(biāo)記前后菌株的解磷能力比較

溶磷圈可以展現(xiàn)解磷菌解磷能力的大小，溶磷圈直徑與菌落直徑比值越大，說明解磷能力越強(qiáng)[19]。

由表 2 可知，w134 的 D/d 高于 w134GFP，分別為 1.37 和 1.29；w137 的 D/d 高于 w137GFP，分別為1.66 和1.57，且標(biāo)記前后的D/d 無顯著差異（P＞0.05）。說明GFP 標(biāo)記后均在磷酸三鈣平板上的解磷能力略有下降，但差異不顯著（P＜0.05）。

表2 GFP 標(biāo)記前后菌株在NBRIP 平板上的溶磷圈

菌株的解磷能力一般以NBRIP 培養(yǎng)液中有效磷的多少來衡量[19]。由圖3 可知，標(biāo)記菌在NBRIP培養(yǎng)液中有效磷含量的變化曲線和對應(yīng)的野生菌基本一致；w134 和w134GFP 在NBRIP 培養(yǎng)液中最大有效磷含量分別為 562.07、529.68 mg/L（圖3-A），w137 和 w137GFP 在 NBRIP 培養(yǎng)液中最大有效磷含量分別為624.35、596.32 mg/L（圖3-B）。可見，GFP 標(biāo)記后w134 和w137 的解磷能力均有所降低，但是沒有造成菌株解磷能力的顯著降低或者喪失。

2.5 標(biāo)記菌在復(fù)墾土壤中的定殖動(dòng)態(tài)

不同處理?xiàng)l件下標(biāo)記菌在復(fù)墾土壤中90 d 定殖動(dòng)態(tài)變化如圖4 所示，從總體上看，不論土壤是否滅菌、是否添加有機(jī)肥，w134GFP 和w137GFP 的定殖數(shù)量都是隨時(shí)間的延長逐漸降低。2 株菌在接種7 d 達(dá)到定殖數(shù)量的最高值，w134GFP 的數(shù)量在7.6×108cfu/g，w137GFP 的數(shù)量在 9.8×109cfu/g；接種 35 d 時(shí)，2 株菌數(shù)量分別降到 4.6×104、4.5×104cfu/g；接種 93 d，2 株菌數(shù)量已降至 10～20 cfu/g，達(dá)到檢測的下限。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，未滅菌土壤＋有機(jī)肥（NM）處理下的菌體數(shù)量在28～58 d 時(shí)高于未滅菌土壤不施肥（N）處理，即NM＋w134GFP＞N＋w134GFP，NM＋w137GFP＞N＋w137GFP；而滅菌土壤＋有機(jī)肥（SM）處理下的菌體定殖數(shù)量在0～28 d 高于滅菌土壤不施肥（S）處理，即SM＋w134GFP＞S＋w134GFP，SM＋w137GFP＞S＋w137GFP?？梢?，添加有機(jī)肥可以促進(jìn)w134GFP 和w137GFP 在復(fù)墾土壤中的定殖。

不施有機(jī)肥時(shí)，在0～21 d，滅菌土壤（S）中的標(biāo)記菌數(shù)量高于未滅菌土壤（N），即S＋w134GFP＞N＋w134GFP，S＋w137GFP＞N＋w137GFP；到 28 d 時(shí)滅菌土壤（S）處理均低于不滅菌土壤（N）處理；28 d后土壤滅菌和不滅菌處理間的菌體數(shù)量基本持平。添加有機(jī)肥（M）時(shí)，在0～28 d 滅菌土壤＋有機(jī)肥（SM）處理中標(biāo)記菌數(shù)量高于不滅菌土壤＋有機(jī)肥（NM）處理的，即 SM＋w134GFP＞NM＋w134GFP，SM＋w137GFP＞NM＋w137GFP；在 28～58 d 時(shí)生長發(fā)生逆轉(zhuǎn)，不滅菌土壤+有機(jī)肥（NM）處理中的標(biāo)記菌數(shù)量高于滅菌土壤＋有機(jī)肥（SM）處理，58 d之后二者菌體數(shù)量持平。

從2 株標(biāo)記菌的整個(gè)定殖過程來看，4 個(gè)處理的定殖效果也不盡相同，0～28 d，滅菌土壤+有機(jī)肥（SM）處理的菌體數(shù)量高于其他3 個(gè)處理；28～58 d，不滅菌土壤＋有機(jī)肥（NM）的菌體數(shù)量高于其他3 個(gè)處理；58 d 之后4 個(gè)處理之間菌體數(shù)量差異不大。

3 討論

3.1 GFP 標(biāo)記對菌體生長和解磷能力的影響

綠色熒光蛋白（GFP）以標(biāo)記基因小、基因表達(dá)產(chǎn)物對細(xì)胞沒有毒害的作用、安全穩(wěn)定、熒光標(biāo)記檢測方便等優(yōu)點(diǎn)[14]，成為研究功能微生物在自然環(huán)境中存活與定殖狀況的有效手段。許多研究證實(shí)[15-17，20]，GFP 可對不同物種進(jìn)行標(biāo)記，而且標(biāo)記菌株與出發(fā)菌株的生長速率無明顯差別，功能活性相當(dāng)，連續(xù)培養(yǎng)條件下標(biāo)記菌株的GFP 可穩(wěn)定遺傳。本試驗(yàn)也采用了GFP 標(biāo)記，而且經(jīng)過連續(xù)15 代的無選擇壓力的傳代培養(yǎng)，熒光顯微鏡下仍能看見強(qiáng)烈的綠色熒光，并能提取出相應(yīng)的質(zhì)粒。說明GFP質(zhì)粒表達(dá)穩(wěn)定，解磷菌w134 和w137 的GFP 標(biāo)記菌株構(gòu)建成功。

從生長曲線來看，標(biāo)記菌的生長曲線與野生菌的基本一致，只是標(biāo)記菌在前7～8 h 的OD 值略低于野生菌?？梢姡氲腉FP 質(zhì)粒還是稍微增加了細(xì)胞的代謝負(fù)荷，削弱了菌株的適應(yīng)性。這與李曉婷[16]的研究結(jié)果一致。

雖然有研究認(rèn)為，解磷圈的大小不能準(zhǔn)確反映解磷能力的強(qiáng)弱[19]，但對于同一菌株來說，溶磷圈仍舊可以粗略地展現(xiàn)GFP 標(biāo)記前后解磷能力的變化。本研究中，標(biāo)記菌的D/d 值略小于野生菌，應(yīng)該是受導(dǎo)入質(zhì)粒的影響。通常，研究解磷能力還是以NBRIP 培養(yǎng)液中有效磷的多少來衡量。本研究結(jié)果表明，標(biāo)記菌和野生菌在NBRIP 培養(yǎng)液中解磷能力沒有顯著差別，說明GFP 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入對w134 和w137的解磷能力影響不大。張磊等[20]和張霞等[21]的研究也發(fā)現(xiàn)，GFP 基因的導(dǎo)入基本不影響解磷菌的解磷能力?？傊?，GFP 標(biāo)記對w134 和w137 的生長和解磷能力沒有顯著影響，而且GFP 質(zhì)粒遺傳穩(wěn)定，可以用于后續(xù)的定殖試驗(yàn)。

3.2 解磷菌在復(fù)墾土壤中的定殖

外來功能菌在自然土壤中定殖的典型特征是：在接種后最初幾天細(xì)菌群體的生長呈增加趨勢，然后開始持續(xù)下降直至檢測下限（約50 cfu/g）。本研究結(jié)果表明，w134GFP 和w137GFP 在復(fù)墾土壤中的定殖數(shù)量在接種7 d 時(shí)達(dá)最大值分別為7.6×108、9.8×109cfu/g；之后逐漸降低，35 d 降到 4.5×104cfu/g；93 d 降到 10～20 cfu/g。喬志偉[19]研究發(fā)現(xiàn)，在磷細(xì)菌＋葡萄糖＋尿素＋基質(zhì)處理的土壤中，磷細(xì)菌數(shù)量在接種7 d 達(dá)到最大值1.0×108cfu/g，隨后逐漸降低，60 d 降到約3.3×104cfu/g，與本研究定殖規(guī)律類似。但也有研究發(fā)現(xiàn)，解磷菌在土壤中的定殖數(shù)量一直呈下降趨勢，沒有增加現(xiàn)象。李曉婷等[16]研究發(fā)現(xiàn)，解磷菌K3 在土壤中數(shù)量在35 d內(nèi)從 1.0×109cfu/g 降低到 1.0×103cfu/g 左右；張霞等[21]研究發(fā)現(xiàn)，GFP 標(biāo)記菌與出發(fā)菌株在土壤中的消長動(dòng)態(tài)相似，隨時(shí)間延長定殖數(shù)量下降，接種60 d 的數(shù)量分別為 1.63×104、3.30×102cfu/g，100 d檢測不到。王珍等[22]研究也發(fā)現(xiàn)，解磷菌WY4-GFP在小白菜根際及土壤中的定殖規(guī)律是隨時(shí)間的增加定殖數(shù)量逐漸減少。外來微生物定殖數(shù)量緩慢下降是一個(gè)共性的現(xiàn)象，但不同菌株在土壤中定殖的數(shù)量和時(shí)間，以及會(huì)不會(huì)在接種的最初幾天里數(shù)量增加，都不盡相同。這可能是由于植物根系與微生物[23]、微生物之間相互作用的復(fù)雜性，以及土壤質(zhì)地、水分特征等理化性質(zhì)的影響[24]，因此，很難對所觀察到這一現(xiàn)象進(jìn)行理論上的分析，要揭示環(huán)境因子對菌株定殖的影響，還有待今后深入研究。

在土壤是否滅菌上，韋兵等[25]研究發(fā)現(xiàn)，滅菌土壤中JK45-L 菌的數(shù)量下降的速度明顯比不滅菌土壤中慢；王平等[24]也研究發(fā)現(xiàn)，熒光假單胞菌X16L2 在滅菌土壤中的存活量要顯著高于不滅菌土壤。本試驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)，在接菌的前28 d內(nèi)，滅菌土壤組中w134GFP 和w137GFP 的定殖數(shù)量高于對應(yīng)的未滅菌土壤中的定殖數(shù)量?？梢姡c自然土壤相比，滅菌土壤中因沒有土著微生物的拮抗作用和競爭作用，也沒有原生動(dòng)物的捕食作用以及噬菌體引起的細(xì)胞潰溶，外來微生物更容易定殖。但隨著時(shí)間延長，土壤滅菌和不滅菌對定殖的影響逐漸減小。58 d 時(shí)，土壤滅菌組的標(biāo)記菌數(shù)量在（2.3～3.1）×103cfu/g，未滅菌土壤組的標(biāo)記菌數(shù)量在（2.6～4.5）×103cfu/g，差別不大。余旋[26]研究也有類似的發(fā)現(xiàn)，滅菌土和未滅菌土中接種的磷細(xì)菌數(shù)量在60 d 后分別為 3.38×103、3.40×103cfu/g，滅菌土和未滅菌土中接種的磷細(xì)菌數(shù)量相當(dāng)。

外來微生物施入土壤發(fā)揮作用的一個(gè)前提條件就是要能夠進(jìn)行有效定殖，在諸多影響外來菌株根際定殖的因素中，首先是土壤或根系分泌的營養(yǎng)物質(zhì)對外來微生物的影響。NINWE 等[27]將GFP 標(biāo)記的熒光假單胞菌SBW25 施入土壤中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SBW25 的很大一部分變得不活躍或者死亡，這可能表明細(xì)胞在土壤中進(jìn)入休眠狀態(tài)，類似于在純培養(yǎng)的饑餓條件下觀察到的。NORMANDE 等[28]也研究發(fā)現(xiàn)，將熒光假單胞菌DR54-BN14 接種到土壤中21～28 d 后，DR54-BN14 細(xì)胞大部分處于饑餓狀態(tài)。而虞偉斌[29]則研究發(fā)現(xiàn)，添加有機(jī)肥能促進(jìn)解磷菌GFPK3 在土壤中的定殖。本研究也發(fā)現(xiàn)，在配施有機(jī)肥的處理中，滅菌土壤中標(biāo)記菌的數(shù)量在21～35 d 高于不施肥處理，類似地自然土壤中標(biāo)記菌數(shù)量在28～42 d 高于對應(yīng)的不施肥處理，這可能是由于配施有機(jī)肥的作用。復(fù)墾土壤養(yǎng)分貧瘠，可供微生物生長的能源物質(zhì)較少，解磷菌從室內(nèi)分離培養(yǎng)到釋放復(fù)墾土壤中，營養(yǎng)條件發(fā)生巨大的反差，容易造成菌體死亡或休眠，而有機(jī)肥可以給菌株提供合適的碳氮源以及生存空間，增強(qiáng)其在復(fù)墾土壤中的定殖能力。

本試驗(yàn)利用電擊轉(zhuǎn)化法獲得了遺傳穩(wěn)定的GFP 標(biāo)記菌株w134GFP 和w137GFP，并且標(biāo)記菌和野生菌在生長曲線和解磷能力上無顯著差異。對標(biāo)記菌在復(fù)墾土壤中的定殖能力進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，w134GFP 和 w137GFP 均在接種 7 d 達(dá)到定殖數(shù)量的最高值，分別為 7.6×108、9.8×109cfu/g，之后標(biāo)記菌數(shù)量逐漸下降，可在復(fù)墾土壤中定殖93 d左右。說明w134GFP 和w137GFP 可以作為研究解磷菌在復(fù)墾土壤中定殖能力的特征材料，對進(jìn)一步揭示解磷菌在復(fù)墾土壤中的生態(tài)功能奠定基礎(chǔ)。