阮 娟，章 軍，錢海生

(1.合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.安徽醫(yī)科大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，安徽 合肥 230032)

引言

地球上的細(xì)菌數(shù)量約為5×1030種，大大超過(guò)了動(dòng)植物的總數(shù)[1-2]。雖然b細(xì)菌對(duì)人類無(wú)害甚至有益，但相當(dāng)多的細(xì)菌具有傳染性，甚至可導(dǎo)致致命疾病，傳染病對(duì)公共衛(wèi)生、經(jīng)濟(jì)和精神健康造成了巨大負(fù)擔(dān)[3-4]。例如，新冠肺炎(COVID-19)疫情在全球范圍內(nèi)爆發(fā)，嚴(yán)重威脅全球公共衛(wèi)生安全。最新的臨床報(bào)告顯示，許多COVID-19患者死于繼發(fā)感染，包括耐抗生素細(xì)菌感染，而不是病毒本身[5-6]。一旦細(xì)菌接觸到傷口，它們就會(huì)利用傷口周圍的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并開(kāi)始以驚人的速度生長(zhǎng)，導(dǎo)致傷口感染和發(fā)炎。近年來(lái)抗生素已成為治療細(xì)菌感染性疾病最常用的抗菌藥物。盡管抗生素本身具有殺滅細(xì)菌的能力，而且容易獲得，但抗生素的過(guò)度使用和濫用在很大程度上抑制了它們的有效性，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性，甚至超級(jí)細(xì)菌的出現(xiàn)[7]。因此，探索無(wú)抗生素治療方案對(duì)治療細(xì)菌感染性疾病具有重要意義。

光動(dòng)力療法(PDT)是目前用于治療惡性腫瘤的一種重要方法，近年來(lái)，由于其獨(dú)特的作用機(jī)制，PDT在對(duì)抗細(xì)菌感染方面引起了廣泛的關(guān)注。PDT使用一種無(wú)毒的光敏劑在光激活時(shí)原位產(chǎn)生高毒性的活性氧(ROS)，這種新出現(xiàn)的方法也被稱為光動(dòng)力抗菌，它被認(rèn)為是治療感染性疾病(特別是局部感染引起的疾病)的一種有希望的替代方法。與常規(guī)抗菌藥物治療相比，光動(dòng)力抗菌試劑具有療效快、選擇性好、可忽略全身毒性、反復(fù)光敏治療不存在耐藥性等明顯優(yōu)勢(shì)。迄今為止，人們研究了大量的光敏化合物[8]。Li等人設(shè)計(jì)了Bi2S3/Ti3C2Tx的肖特基結(jié)構(gòu)，在808nm的近紅外光照射下可殺死99.86%的金黃色葡萄球菌和99.92%的大腸桿菌[9]。Sun等人設(shè)計(jì)了BiOI納米片，具有較好的電子結(jié)構(gòu)，在808nm光照射下具有更高的殺滅大腸桿菌的活性[10]。構(gòu)建具有優(yōu)異光催化性能的復(fù)合納米結(jié)構(gòu)是光動(dòng)力抗菌的重要研究方向。

ZnIn2S4具有良好的可見(jiàn)光吸收是一種具有優(yōu)異光催化性能和生物相容性的三元硫化物。然而，單一的ZnIn2S4光生電子和空穴的復(fù)合率較高，導(dǎo)致光催化效率較低，限制了其實(shí)際應(yīng)用。為了提高ZnIn2S4的光催化活性，采用了各種策略，如構(gòu)建異質(zhì)結(jié)、控制形貌、摻雜過(guò)渡金屬等[11-13]。本文設(shè)計(jì)了一種In2S3-ZnIn2S4復(fù)合結(jié)構(gòu)，摻雜了In2S3后，帶隙變窄，在可見(jiàn)光的照射下，電子躍遷更容易發(fā)生，在可見(jiàn)光的照射下產(chǎn)生ROS的效率更高。我們選擇了大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為細(xì)菌模型，體外抗菌實(shí)驗(yàn)證明In2S3-ZnIn2S4復(fù)合結(jié)構(gòu)比單一的ZnIn2S4具有更高的抗菌活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

十六烷基三甲基溴化銨(CTAB，99%)，亞甲基藍(lán)(MB，90%)，L-抗壞血酸(AA，99%)，對(duì)苯二甲酸(TA，99%)均購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司。9,10-蒽基-雙(亞甲基)二丙二酸(ABDA，99%)購(gòu)于南京哈柏醫(yī)藥科技有限公司。LB瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)于上海博微生物科技有限公司。烏洛托品(HMTA，99%)，六水合硝酸鋅(Zn(NO3)2·6H2O，99.99%)，硫代乙酰苯胺(TAA，98%)六水合氯化銦(InCl3·6H2O，99.0%)均購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

透射電子顯微鏡(TEM，JEM-2100F，日本日立)，高分辨率透射電子顯微鏡(HRTEM，JEM-2100F，日本日立)，場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(FESEM，SU8020，日本日立)，X-射線粉末衍射儀(XRD，X’Pert PRO MPD，Cu靶作為輻射源，掃描范圍2θ為10°～70°，荷蘭)，X射線光電子能譜(XPS， ESCALAB250Xi，Thermo Scientific，美國(guó))，紫外分光光度計(jì)(U-5100，日立高新技術(shù)公司，日本)。

1.2 In2S3-ZnIn2S4復(fù)合結(jié)構(gòu)的合成

以之前報(bào)道的高活性AA-[Zn(OH)4]2-納米球?yàn)橛材０?，采用水熱法合成了In2S3-ZnIn2S4復(fù)合納米結(jié)構(gòu)。將40mg AA-[Zn(OH)4]2-納米球分散在20mL去離子水中，隨后加入10mL溶有InCl3·6H2O(0.8mmol)和TAA(3.2mmol)的水溶液，在常溫下攪拌1h后，將上述溶液轉(zhuǎn)移到50mL的聚四氟乙烯內(nèi)襯的不銹鋼高壓反應(yīng)釜中，密封并且在180℃下反應(yīng)4h，隨后，自然冷卻至室溫，用去離子水離心洗滌三次，冷凍干燥后收集備用。

1.3 單一組分的In2S3和ZnIn2S4的合成

ZnIn2S4的合成是將高活性的AA-[Zn(OH)4]2-鋅源換成Zn(NO3)2·6H2O。將0.2mmol的Zn(NO3)2·6H2O充分溶解于20mL去離子水中，隨后加入10mL溶有0.4mmol的InCl3·6H2O和0.8mmol的TAA的去離子水，在常溫下攪拌1h后，在180℃下通過(guò)水熱反應(yīng)4h，隨后，自然冷卻至室溫，用去離子水離心洗滌三次，冷凍干燥后收集備用。In2S3的合成是將0.4mmol的InCl3·6H2O和0.8mmol的TAA溶于30mL的去離子水中，在常溫下攪拌1h后，在180℃下通過(guò)水熱反應(yīng)4h，隨后，自然冷卻至室溫，用去離子水離心洗滌三次，冷凍干燥后收集備用。

1.4 In2S3-ZnIn2S4體外光動(dòng)力效果檢測(cè)

(1)亞甲基藍(lán)(MB)降解實(shí)驗(yàn)

通過(guò)活性氧檢測(cè)探針MB來(lái)檢測(cè)In2S3-ZnIn2S4體外光動(dòng)力效果。在40mL的MB(10μg/mL)溶液中加入200μg/mL的In2S3-ZnIn2S4納米粒子，在黑暗中攪拌1h，達(dá)到吸附-脫附平衡。接著用功率密度為100mW/cm2氙燈(相當(dāng)于一個(gè)太陽(yáng)光強(qiáng)度)模擬外源光光照(濾光片濾去波長(zhǎng)<400nm的紫外光)照射上述溶液，每隔5min取一次溶液，離心去除In2S3-ZnIn2S4納米粒子，取上清液用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定上清液在665nm處的吸光度。

(2)羥基自由基(·OH)檢測(cè)

引入對(duì)苯二甲酸(TA)作為標(biāo)準(zhǔn)試劑來(lái)評(píng)估·OH的產(chǎn)生，·OH會(huì)使TA氧化形成具有強(qiáng)熒光的羥基對(duì)苯二甲酸(TAOH)，用熒光光譜儀檢測(cè)熒光的強(qiáng)度間接檢測(cè)·OH的產(chǎn)生；首先，稱取830mg對(duì)苯二甲酸加入到50mL NaOH溶液(0.01M)中超聲溶解。然后，將10.00mg In2S3-ZnIn2S4加入TAOH溶液中，避光攪拌1h，使溶液達(dá)到吸附-脫附平衡。然后，用100mW/cm2氙燈模擬外源光光照，每隔10min取出3mL的反應(yīng)液，離心后取上層清液并測(cè)定熒光光譜。

(3)單線態(tài)氧(1O2)檢測(cè)

引入9，10-蒽二甲雙(亞甲基)二丙二酸(ABDA)通過(guò)UV-Vis光譜來(lái)檢測(cè)1O2的產(chǎn)生。首先，將0.5mg In2S3-ZnIn2S4添加到2mL ABDA的PBS溶液(0.1M,pH=7.4)中，黑暗攪拌1h，使溶液達(dá)到吸附-脫附平衡，用100mW/cm2氙燈模擬外源光光照，每隔10min取出3mL的溶液，離心后取上清液測(cè)其在379nm處的吸光度。

1.5 In2S3-ZnIn2S4抗菌效果檢測(cè)

首先于錐形瓶中按比例配置一定量的瓊脂培養(yǎng)基與肉湯培養(yǎng)基(50mL)，將其與后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需的試劑及培養(yǎng)皿等于高壓滅菌鍋中滅菌(121℃，20min)。滅菌結(jié)束后，在潔凈工作臺(tái)中，將瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，待其冷卻凝固至室溫，紫外燈照射后，備用。然后取大腸桿菌懸液50μL加入已滅菌的肉湯培養(yǎng)基中，并將其置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h。接著用無(wú)菌水將材料In2S3-ZnIn2S4(ZnIn2S4或In2S3)配置為1mg/mL母液，超聲使其分散均勻，于紫外燈照射30min，備用。在超凈工作臺(tái)中，點(diǎn)燃酒精燈，用無(wú)菌水將材料稀釋至200μg/mL，將9mL材料溶液與培養(yǎng)12h后的大腸桿菌懸液1mL于試管中混合均勻，避光條件下，在恒溫?fù)u床中(37℃，轉(zhuǎn)速180r/min)培養(yǎng)1h，使其達(dá)到吸附-脫附平衡。然后用100mW/cm2的氙燈模擬外源光照射，每隔10min取樣品1mL，逐級(jí)稀釋至105倍，接著吸取100μL In2S3-ZnIn2S4水溶液涂布在瓊脂培養(yǎng)基表面，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，最后對(duì)菌落個(gè)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 花狀結(jié)構(gòu)In2S3-ZnIn2S4的形貌表征

采用高活性AA-[Zn(OH)4]2-非晶納米球作為硬模板，在含有銦源和硫源的水溶液中通過(guò)陽(yáng)離子交換策略合成了花狀結(jié)構(gòu)的In2S3-ZnIn2S4。采用SEM對(duì)合成AA-[Zn(OH)4]2-進(jìn)行表征。如圖1a所示，AA-[Zn(OH)4]2-非晶納米球的SEM照片顯示其直徑約350nm，且大小均一，單分散性良好。在獲得AA-[Zn(OH)4]2-復(fù)合微球的基礎(chǔ)上，采用水熱法進(jìn)一步制備了In2S3-ZnIn2S4復(fù)合結(jié)構(gòu)。

如圖1d所示，In2S3-ZnIn2S4復(fù)合結(jié)構(gòu)的主體是片層組裝的花狀結(jié)構(gòu)的ZnIn2S4納米球(圖1b，c)。圖1e放大的TEM圖像顯示，在二維ZnIn2S4片層上附著一些無(wú)定型的小顆粒。如圖1f所示，HRTEM圖像顯示復(fù)合結(jié)構(gòu)中存在兩種不同的晶格。其中3.01?的晶格條紋對(duì)應(yīng)In2S3的(215)晶面，1.96?的晶格條紋對(duì)應(yīng)ZnIn2S4的(110)晶面，該結(jié)果證明了附著的小顆粒為In2S3。通過(guò)掃描透射電子顯微鏡(STEM)分析復(fù)合結(jié)構(gòu)中的元素分布。如圖1i～k所示，元素映射圖表明Zn，In和S的元素均勻分布在復(fù)合結(jié)構(gòu)中，但是各元素的分布沒(méi)有出現(xiàn)明顯的分界，所以該復(fù)合機(jī)構(gòu)的物相需要進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

圖1 形貌圖((a)AA-[Zn(OH)4]2-的SEM圖像；ZnIn2S4的(b)SEM圖像和(c)TEM圖像；In2S3-ZnIn2S4復(fù)合結(jié)構(gòu)的(d)(e)TEM圖像，(f)HRTEM圖像，(h)STEM圖像和(i-k)元素分布圖)

2.2 In2S3-ZnIn2S4復(fù)合結(jié)構(gòu)的物相分析和元素分析

采用XRD對(duì)樣品的物相進(jìn)行進(jìn)一步分析，圖2a中的In2S3-ZnIn2S4的XRD圖像顯示樣品與六方相的In2S3晶體(JCPDS No.25-0390)和ZnIn2S4晶體(JCPDS No.48-1778)的標(biāo)準(zhǔn)衍射峰分別對(duì)應(yīng)，表明In2S3-ZnIn2S4復(fù)合結(jié)構(gòu)的成功制備。利用XPS對(duì)In2S3-ZnIn2S4的元素組成和各元素的化學(xué)價(jià)態(tài)進(jìn)行了分析。如圖2b，c，d所示，在452.53eV和444.93eV處的結(jié)合能對(duì)應(yīng)著In3+3d，在1022.98eV和1046.08eV處的結(jié)合能對(duì)應(yīng)著Zn2+2p，在1161.68eV處的結(jié)合能對(duì)應(yīng)著S2-2p。由上述結(jié)果可以確定樣品中的元素分別為In3+，Zn2+和S2-。

圖2 In2S3-ZnIn2S4復(fù)合結(jié)構(gòu)的物相和元素圖譜((a)XRD圖譜；XPS圖譜：(b)In；(c)Zn；(d)S)

為了得到各個(gè)元素的具體占比，我們利用能量色散X射線光譜儀(EDX)對(duì)各個(gè)元素含量進(jìn)行定量分析(圖3)。如表1所示，In∶Zn∶S的原子組成百分比約為5∶1∶8，其中Zn的原子百分比少，證明了該復(fù)合結(jié)構(gòu)中不完全是ZnIn2S4，還存在In2S3。

圖3 In2S3-ZnIn2S4復(fù)合結(jié)構(gòu)的EDX能譜

表1 In2S3-ZnIn2S4復(fù)合結(jié)構(gòu)的EDX元素比例分析

2.3 In2S3-ZnIn2S4復(fù)合結(jié)構(gòu)的光吸收

如圖4的In2S3-ZnIn2S4復(fù)合結(jié)構(gòu)和ZnIn2S4的紫外-可見(jiàn)-近紅外吸收譜所示，單一的ZnIn2S4的最大吸收峰約在450nm處(可見(jiàn)光區(qū)域)，與單一的ZnIn2S4相比，In2S3-ZnIn2S4復(fù)合結(jié)構(gòu)的最大吸收峰向長(zhǎng)波長(zhǎng)方向移動(dòng)，發(fā)生了紅移，帶隙減小到2.3eV。說(shuō)明摻雜了In2S3后，帶隙變窄，在可見(jiàn)光的照射下，電子躍遷更容易發(fā)生，光催化效率更好。

圖4 In2S3-ZnIn2S4和ZnIn2S4的光吸收((a)吸收光譜；(b)庫(kù)伯卡-曼克反射函數(shù))

2.4 In2S3-ZnIn2S4復(fù)合結(jié)構(gòu)在可見(jiàn)光照射下產(chǎn)生活性氧性能分析

為了驗(yàn)證In2S3-ZnIn2S4復(fù)合結(jié)構(gòu)在可見(jiàn)光照射下可以產(chǎn)生ROS，我們采用ROS檢測(cè)探針MB，通過(guò)觀察其顏色變化和在664nm處特征吸收峰的變化可以判斷是否產(chǎn)生了活性氧。從圖5a中可以看出隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)，MB在664nm處的特征峰值逐漸下降，表明In2S3-ZnIn2S4在可見(jiàn)光照射下具有良好的產(chǎn)生活性氧能力。由圖5b,c的降解速率曲線和反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線分析可發(fā)現(xiàn)，與單一組分的In2S3和ZnIn2S4相比，In2S3-ZnIn2S4復(fù)合結(jié)構(gòu)顯示出更優(yōu)異的光催化能力。光照35min后In2S3-ZnIn2S4復(fù)合結(jié)構(gòu)對(duì)MB的降解率為93%，而單一結(jié)構(gòu)的In2S3和ZnIn2S4對(duì)MB的降解率只有65%和70%。說(shuō)明In2S3的摻雜降低了ZnIn2S4的帶隙，提高了其光動(dòng)力產(chǎn)生活性氧能力。如圖5d所示，In2S3-ZnIn2S4在光照三次后，依舊具有較高的產(chǎn)生活性氧的能力，表明該復(fù)合結(jié)構(gòu)具有良好的光穩(wěn)定性。

圖5 (a)In2S3-ZnIn2S4降解MB不同時(shí)間的吸收光譜；In2S3，ZnIn2S4和In2S3-ZnIn2S4復(fù)合結(jié)構(gòu)在可見(jiàn)光照射下降解MB的(b)降解速率曲線和(c)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線(C0和Ct分別是第0、5、10、15、20、15、35分鐘MB溶液在664nm處的吸光度)；(d)In2S3-ZnIn2S4復(fù)合結(jié)構(gòu)對(duì)MB的降解三次循環(huán)實(shí)驗(yàn)

為了更進(jìn)一步探究其機(jī)理，我們引入TA和ABDA檢測(cè)所產(chǎn)生活性氧的種類。圖6a顯示加光照后隨時(shí)間延長(zhǎng)，熒光沒(méi)有明顯增加，說(shuō)明只有少量羥基自由基(·OH)產(chǎn)生，·OH不是主要的活性氧物質(zhì)。圖6b顯示，ABDA紫外吸收隨時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，說(shuō)明光照下In2S3-ZnIn2S4復(fù)合納米結(jié)構(gòu)持續(xù)產(chǎn)生單線態(tài)氧(1O2)將ABDA氧化，證明1O2為主要產(chǎn)物。

圖6 在In2S3-ZnIn2S4處理下不同時(shí)間光譜圖((a)TA的熒光光譜；(b)ABDA溶液的UV-Vis吸收光譜(100mW/cm2的氙燈照射))

2.5 In2S3-ZnIn2S4抗菌性能

基于所制備的In2S3-ZnIn2S4復(fù)合納米結(jié)構(gòu)良好的光照產(chǎn)生ROS性能，我們展開(kāi)了光動(dòng)力抗菌檢測(cè)。如圖7a，b所示，對(duì)于革蘭氏陰性菌大腸桿菌在沒(méi)有光照下In2S3、ZnIn2S4和In2S3-ZnIn2S4都不能有效抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)，在100mW/cm2的氙燈照射10min后，單獨(dú)In2S3或ZnIn2S4能抑制大腸桿菌生長(zhǎng)，但不能將其有效消滅。In2S3-ZnIn2S4復(fù)合納米結(jié)構(gòu)能夠完全抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)，將大腸桿菌有效消滅；對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性菌金黃葡萄球菌，得到與大腸桿菌相類似的抗菌結(jié)果(圖7b，c)。

圖7 抗菌性能測(cè)試(在沒(méi)有和有氙燈照射下用In2S3、ZnIn2S4和In2S3-ZnIn2S4處理后(a)大腸桿菌菌落的照片；(b)孵育后的大腸桿菌相對(duì)活力;(c)金黃色葡萄球菌菌落的照片；(d)孵育后的金黃色葡萄球菌相對(duì)活力(通過(guò)Image J菌落計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)細(xì)菌數(shù)量；In2S3、ZnIn2S4和In2S3-ZnIn2S4的濃度為150μg/mL，100mW/cm2的氙燈照射10min))

接下來(lái)我們進(jìn)一步探究In2S3-ZnIn2S4復(fù)合納米結(jié)構(gòu)的有效殺菌濃度(MBC)，設(shè)置系列濃度梯度的In2S3-ZnIn2S4復(fù)合納米結(jié)構(gòu)與細(xì)菌共孵育24h后加100mW/cm2的氙燈照射10min，并用稀釋涂布平板法統(tǒng)計(jì)各組細(xì)菌生長(zhǎng)情況，用Image J統(tǒng)計(jì)各組細(xì)菌數(shù)量，進(jìn)而得出最小殺菌濃度。如圖8所示，In2S3-ZnIn2S4復(fù)合納米結(jié)構(gòu)在100mW/cm2的氙燈照射下(10min)對(duì)于大腸桿菌和金黃葡萄球菌最小殺菌濃度均在200μg/mL。

圖8 In2S3-ZnIn2S4復(fù)合納米材料對(duì)大腸桿菌和金黃葡萄球菌最小殺菌濃度測(cè)試Fig.8 Minimum bactericidal concentration test of In2S3-ZnIn2S4 composite nanomaterials against E.coli and S.aureus

3 結(jié)論

本文利用高活性的AA-[Zn(OH)4]2-納米球作為模板，通過(guò)水熱法制備了花狀結(jié)構(gòu)的In2S3-ZnIn2S4復(fù)合納米球。體外的MB降解實(shí)驗(yàn)顯示與單一的In2S3和ZnIn2S4結(jié)構(gòu)相比，In2S3-ZnIn2S4復(fù)合結(jié)構(gòu)的帶隙更窄，能夠產(chǎn)生更有效的電荷-空穴分離，在可見(jiàn)光照射下產(chǎn)生活性氧能力更強(qiáng)。單線態(tài)氧探針ABDA檢測(cè)出該復(fù)合結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的活性氧種類為1O2。體外光動(dòng)力抗菌結(jié)果顯示，在100mW/cm2的氙燈照射10min后，In2S3-ZnIn2S4復(fù)合納米結(jié)構(gòu)能完全抑制革蘭氏陰性大腸桿菌和革蘭氏陽(yáng)性金黃葡萄球菌的生長(zhǎng)，最小殺菌濃度均在200μg/mL，是一種優(yōu)異的光動(dòng)力抗菌材料。