李東明 何升

（1.廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣西南寧 530012；2.廣西壯族自治區(qū)出生缺陷研究所，廣西南寧 530012）

廣西是我國地中海貧血的高發(fā)地區(qū)，人群中α、β及α合并β地中海貧血發(fā)生率分別為12.51%~15.35%、5.11%~6.64%和1.47%~2.08%［1-2］。重型α地中海貧血患兒多在出生后死亡，中重型β地中海貧血患兒表現(xiàn)為中、重度貧血，由于缺乏有效的治療措施，絕大多數(shù)患兒依靠輸血維持生命，這給該類患兒家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)［3］。2010年以來，廣西政府加強(qiáng)了對地中海貧血的防控，建立并逐步完善了三級防控體系，加大了資金投入，增加了人員培訓(xùn)，在一、二級預(yù)防方面取得了豐碩的成果，極大地減少了重度地中海貧血患兒的出生［4］。然而在三級預(yù)防方面的投入及報(bào)道相對較少，報(bào)道的病例數(shù)及基因型種類不多。為此本研究對2011~2019年在廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院出生、行健康體檢、住院，以及外院轉(zhuǎn)診的30 417例地中海貧血篩查陽性患兒進(jìn)行基因檢測，分析地中海貧血基因突變類型，并對部分患兒進(jìn)行基因序列分析或跨越斷裂點(diǎn)PCR檢測，通過大樣本分析以全面了解本地區(qū)兒童地中海貧血基因型，同時(shí)了解罕見基因型的發(fā)生情況，為地中海貧血患兒診斷、治療及地中海貧血防控政策的不斷完善提供資料。

1 資料與方法

1.1 研究對象

回顧性收集2011年1月至2019年12月在廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院出生、行健康體檢、住院，以及外院轉(zhuǎn)診的地中海貧血篩查陽性患兒30 417例的臨床資料，其中女11 184例，男19 233例，年齡生后1 h至14歲，平均年齡（4±3）歲。本研究獲得廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 篩查

采用血紅細(xì)胞參數(shù)紅細(xì)胞平均體積（mean corpuscular volume，MCV）、紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）聯(lián)合血紅蛋白分析進(jìn)行地中海貧血初篩［1］。（1）MCV<80 fl和/或MCH<27 pg；（2） 血 紅 蛋 白 （hemoglobin，Hb）A2>3.5%和/或F>4.0%；（3）出現(xiàn)異常血紅蛋白區(qū)帶，若以上指標(biāo)任一項(xiàng)異常均判為篩查陽性，并進(jìn)行血清鐵蛋白檢測以排除缺鐵性貧血引起的MCV和/或MCH降低。α地中海貧血表型判斷：MCV<80 fl和/或MCH<27 pg，且HbA2≤3.5%和/或HbF≤4.0%，或出現(xiàn)HbH、HbCS及Hb Bart等異常血紅蛋白；β地中海貧血表型判斷：MCV<80 fl和/或MCH<27 pg，且HbA2>3.5%和/或HbF>4.0%，出現(xiàn)HbE等。

1.3 基因診斷

采集患兒外周靜脈血2 mL于乙二胺四乙酸二鉀抗凝管，采用磁珠法提取基因組DNA，單管多重PCR擴(kuò)增后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測α‐地中海貧血3種常見缺失型基因（‐‐SEA、‐α3.7和‐α4.2），分別采用單管多重PCR擴(kuò)增后經(jīng)反向點(diǎn)雜交技術(shù)進(jìn)行α‐地中海貧血3種基因突變（αCSα、αWSα及αQSα）和β地中海貧血17種常見基因突變（CD41‐42、CD17、IVS‐Ⅱ‐654、CD26、CD71‐72、IVS‐I‐1、 ‐28、CD31、CD43、‐29、CD27‐28、CD14‐15、‐32、Int、IVS‐I‐5、‐30和Cap）檢測，上述α、β地中海貧血基因檢測試劑盒購自深圳益生堂生物技術(shù)有限公司，嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)室操作程序進(jìn)行檢測、質(zhì)量控制和結(jié)果判斷，對上述基因檢測陰性患兒2 703例進(jìn)行跨越斷裂點(diǎn)PCR（gap‐PCR）檢測和/或基因序列分析。

2 結(jié)果

2.1 地中海貧血基因診斷情況

30 417例地中海貧血篩查陽性患兒中，確診地中海貧血23 214例（76.32%）；其中α、β及α合并β地中海貧血檢出率分別為47.77%（14 531/30 417）、23.75%（7 223/30 417）和4.80%（1 460/30 417）。檢出13種α地中海貧血等位基因共計(jì)18 480個(gè)，以‐‐SEA為主（54.99%），包括7種罕見基因：‐‐THAI、HKαα、‐α30、‐α21.9、‐α2.4、‐α1.0和HBA∶2C272‐279 del（表1）。檢出17種β地中海貧血等位基因共計(jì)9 168個(gè)，主要為CD41‐42（47.79%），其次是CD17（25.53%），包括3種罕見基因：IVS‐I‐2、IVS‐Ⅱ‐5和Gγ(Aγδβ)0（表2）。

表1 α地中海貧血等位基因分布

表2 β地中海貧血等位基因分布

2.2 α地中海貧血基因類型分布

14 531例α地中海貧血患兒中，檢出巴氏水腫胎 （‐‐SEA/‐‐SEA）12例 （0.08%），HbH病 （α0/α+）1 916例（13.19%），α地中海貧血基因攜帶者（α0或α+或α+/α+）12 603例（86.73%）。13種等位基因共37種基因類型，以‐‐SEA/αα（52.20%）為主，其次為‐α3.7/αα （13.24%）、αCSα/αα （7.52%）、‐α4.2/αα（6.06%）、‐‐SEA/‐α3.7（5.91%）和αwsα/αα（3.41%），共占88.34%。另檢出11種罕見基因類型共80例，其中‐‐THAI/αα55例（0.38%），‐‐THAI引起的HbH?。é?/α+）17例（0.12%）。見表3。

表3 14 531例兒童α地中海貧血基因類型分布

2.3 β地中海貧血基因類型分布

7 223例β地中海貧血患兒中，檢出雙重雜合子288例（3.99%），純合子102例（1.41%）；檢出16種等位基因共49種基因類型。6種主要基因類型：CD41‐42/βN（45.81%）、CD17/βN（24.30%）、IVS‐Ⅱ‐654/βN（7.49%）、‐28/βN（5.62%）、CD71‐72/βN（4.42%） 和CD26/βN（3.49%）， 共 占91.13%；檢出3種罕見基因類型，包括缺失型Gγ(Aγδβ)0/βN1例，突變型IVS‐Ⅱ‐5/βN和IVS‐Ⅱ‐654/IVS‐Ⅱ‐5各1例。見表4。

表4 7 223例兒童β地中海貧血基因類型分布

2.4 α合并β地中海貧血基因類型分布

1 460例α合并β地中海貧血患兒中，檢出α0/α+合并β地中海貧血134例，β地中海貧血雙重雜合子（67例）和純合子（26例）合并α地中海貧血93例，包括α0/α+合并β地中海貧血雙重雜合子1例，臨床表現(xiàn)為中度貧血；檢出7種α和12種β地中海貧血等位基因共137種基因類型，主要為‐‐SEA/αα 合 并 CD41‐42/βN（14.17%） 、 CD17/βN（8.35%）。見表5。

表5 1 460例α合并β地中海貧血基因類型分布

3 討論

地中海貧血主要發(fā)生在我國長江以南各省，廣西、廣東是地中海貧血的高發(fā)區(qū)，且其在不同地區(qū)及種族人群中的發(fā)生率、基因分布也有一定差異［5］。廣西是壯族自治區(qū)，95%的壯族人群居住在廣西，壯族人群約占總?cè)丝跀?shù)的32%［6］，因此研究本地區(qū)人群中地中海貧血基因類型有重要意義。本研究在30 417例地中海貧血篩查陽性患兒中檢出地中海貧血患兒23 214例，檢出率為76.32%，國內(nèi)報(bào)道疑似患兒中地中海貧血檢出率為31.92%~88.84%［7-8］，這與研究人群、篩查方案等不同有關(guān)。同時(shí)也與是否排除缺鐵性貧血或葡萄糖‐6‐磷酸脫氫酶缺乏等有關(guān)，更重要的是本地區(qū)兒童地中海貧血篩查多采用成人參考指標(biāo)，這勢必會降低檢出率；因此有必要建立兒童地中海貧血篩查及診斷方案，以減少不必要的基因檢測，降低臨床成本。本研究中α地中海貧血仍是主要類型，占62.60%，與以往及國內(nèi)多數(shù)報(bào)道相似［8-11］，而云南地區(qū)報(bào)道貧血兒童中β地中海貧血占53.98%［7］。

已報(bào)道的α、β地中海貧血基因分別超過100種、800種，我國報(bào)道的α、β地中海貧血基因也分別超過30種、60種［12］。本研究在23 214例地中海貧血患兒中檢出α、β地中海貧血基因分別為13種、17種，在18 480個(gè)α地中海貧血等位基因中，主要為‐‐SEA（54.99%），其次為‐α3.7（18.94%） 和αCSα （9.24%）；在7種罕見等位基因中，‐‐THAI占0.43%，廣東湛江地區(qū)、福建泉州地區(qū)分別報(bào)道檢出該基因1例和2例［13-14］，提示該基因在本地區(qū)人群中并不罕見，應(yīng)作為α地中海貧血表型患兒常規(guī)檢測基因。在9 168個(gè)β地中海貧血等位基因中，以CD41‐42為 主 （47.79%）， 其 次 為CD17（25.53%），與重慶、廣東地區(qū)報(bào)道相似［15］，而福建地區(qū)以IVS‐Ⅱ‐654為主［15］，云南地區(qū)以CD17為主［7］。

流行病學(xué)調(diào)查［15］顯示α地中海貧血主要為缺失型‐‐SEA/αα，占57.1%~84.4%，其次為‐α3.7/αα和‐α4.2/αα。本研究在14 531例α地中海貧血患兒中檢出等位基因13種共37種基因類型，其中‐‐SEA/αα最為常見，占52.20%，略低于國內(nèi)報(bào)道［16］，這可能與HbH病檢出比例較高有關(guān)；同時(shí)αCSα/αα（7.52%）高于‐α4.2/αα（6.06%），這與該類患兒更易發(fā)生貧血和毛細(xì)管電泳對Hb的H、CS條帶有較高的識別率相關(guān)［17］。有研究采用臍帶血或新生兒干血斑篩查α地中海貧血對HbH病均有極高的檢出率，因此有必要對新生兒進(jìn)行α地中海貧血篩查，以便對HbH病患兒做到早診斷、早治療，防止貧血程度的進(jìn)展，提高患兒的生活質(zhì)量［17-18］。值得注意的是本研究中檢出巴氏水腫胎（‐‐SEA/‐‐SEA）12例，均在2011年被發(fā)現(xiàn)［10，19］，這表明2010年之后的防控體系能有效地控制重型α地中海貧血患兒的出生。

β地中海貧血多是點(diǎn)突變，國內(nèi)最常見的突變是CD41‐42、CD17、‐28和IVS‐Ⅱ‐654［15］。本研究在7 223例β地中海貧血患兒中共檢出16種等位基因共49種基因類型，主要類型為CD41‐42/βN，其次為CD17/βN、IVS‐Ⅱ‐654/βN、‐28/βN、CD71‐72/βN和CD26/βN，占所有基因類型的91.13%；這與國內(nèi)其他地區(qū)報(bào)道相似［7，15］，但各基因型構(gòu)成在不同地區(qū)存在一定差異。另檢測出罕見突變型IVS‐Ⅱ‐5/βN和IVS‐Ⅱ‐654/IVS‐Ⅱ‐5各1例，1例罕見缺失型Gγ(Aγδβ)0/βN。以往在成人中已報(bào)道過因 缺失型Gγ(Aγδβ)0引起的重度地中海貧血而進(jìn)行產(chǎn)前診斷的病例［20］，結(jié)果提示為避免漏檢罕見基因型，應(yīng)對有β地中海貧血表型而常規(guī)基因檢測陰性患兒進(jìn)行基因序列分析或gap‐PCR檢測。黃爍丹等［21］研究顯示采用毛細(xì)管電泳技術(shù)檢測新生兒干血斑HbA篩查β地中海貧血，能有效地檢出中重型β地中海貧血。本研究中有393例患兒為中重型β地中海貧血，且多以出現(xiàn)不同程度的貧血而被發(fā)現(xiàn)［10］，結(jié)果提示目前的地中海貧血防控措施不能有效地避免中重型β地中海貧血患兒的出生，應(yīng)該引起相關(guān)部門的重視；同時(shí)為了做到對中重型β地中海貧血患兒早期診斷、治療及改善生活質(zhì)量，應(yīng)加強(qiáng)新生兒β地中海貧血篩查。

有研究顯示α合并β地中海貧血患兒在出生時(shí)血液學(xué)多表現(xiàn)為α地中海貧血特點(diǎn)，隨著β珠蛋白表達(dá)增加，2歲后其血液學(xué)多表現(xiàn)為β地中海貧血特點(diǎn)，但其貧血情況較單純α或β地中海貧血輕，且中間型α地中海貧血合并中重型β地中海貧血臨床表現(xiàn)為輕度或中度貧血，無需輸血治療［22-23］。本研究中4.80%的兒童診斷為α合并β地中海貧血，檢出7種α和12種β地中海貧血等位基因共137種基因類型，主要是‐‐SEA/αα 合并CD41‐42/βN（14.17%）、CD17/βN（8.35%），與本地區(qū)其他報(bào)道相似［10，19］。值得注意的是發(fā)現(xiàn) α0/α+地中海貧血合并β地中海貧血134例，β地中海貧血雙重雜合子、純合子合并α地中海貧血92例，包括α0/α+地中海貧血合并β地中海貧血雙重雜合子1例，該病例表現(xiàn)為中度貧血；結(jié)果提示地中海貧血高風(fēng)險(xiǎn)地區(qū)，為檢出α合并β地中海貧血有必要對確診的β地中海貧血患兒進(jìn)行α地中海貧血基因檢測。

廣西地區(qū)兒童中，地中海貧血基因突變及其類型多樣，α地中海貧血仍是主要的類型，其中‐‐SEA/αα是主要基因類型，β地中海貧血主要基因類型為CD41‐42/βN，α合并β地中海貧血所占比例極高。值得注意的是本地區(qū)檢出罕見基因超過10種，其中缺失型‐‐THAI占α地中海貧血基因的0.43%，提示該基因在人群的攜帶率并不低，有必要將其納入常規(guī)檢測的基因類型。2011年后未發(fā)現(xiàn)重型α地中海貧血患兒出生，但中重型β地中海貧血患兒所占比例較高，因此有必要開展新生兒篩查，對篩查陽性患兒行基因診斷，以做到早診斷、早治療，以便提高該類患兒的生活質(zhì)量。同時(shí)，應(yīng)加強(qiáng)育齡高風(fēng)險(xiǎn)人群基因診斷和產(chǎn)前診斷，這對降低本地區(qū)該類患兒出生有重要意義。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。