萬雪瓊，陳 佳，何 超，葉星明

(湖南省胸科醫(yī)院1.綜合科；2.內(nèi)五科；3.胸外科；4.內(nèi)二科,湖南 長沙 410006)

肺癌是全球最常見的多發(fā)惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率均居惡性腫瘤首位，以非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)為主[1]。盡管靶向藥物的開發(fā)和治療措施不斷完善，但腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和耐藥等原因，NSCLC患者總體5年生存率仍較低[2]。與傳統(tǒng)抗腫瘤藥物相比，中藥具有高效、低毒、不良反應(yīng)輕微等特點(diǎn)，是近年來國內(nèi)外抗腫瘤研究的熱點(diǎn)[3]?；ń菑那蚪刑崛苇h(huán)倍半萜類化合物，除具有抗氧化、抗菌、抗感染、解熱和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理特性外，其通過調(diào)控不同途徑對多種腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、侵襲轉(zhuǎn)移以及血管生成具有顯著抑制作用[4]。然而，花姜酮在NSCLC中的抗腫瘤作用并未完全闡明。本研究通過觀察花姜酮對人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549增殖、遷移和侵襲的影響，探討其可能的分子機(jī)制，以期為花姜酮用于NSCLC防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人A549細(xì)胞系(中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所)；胎牛血清、青鏈霉素雙抗(上海江林生物科技有限公司)；花姜酮(純度≥99%)(上海源葉生物)；F-BOX家族F框/WD-40域蛋白7(F-box with 7 tandem WD40，F(xiàn)BXW7)過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-FBXW7)、質(zhì)?？蛰d體(pcDNA)、FBXW7小干擾RNA(si-FBXW7)和小干擾RNA無序陰性對照(si-NC)(上海生工生物工程有限公司)；Trizol試劑、MTT試劑盒(上海晶抗生物工程有限公司)；基質(zhì)膠(Matrigel)、Transwell小室(BD公司)；一步法cDNA合成試劑盒、SYBR Green Master Mix(北京天根生化科技公司)；FBXW7兔單克隆抗體、細(xì)胞周期素D1(cyclinD1)兔單克隆抗體、P21兔單克隆抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)兔單克隆抗體、MMP-9兔單克隆抗體、磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)兔單克隆抗體和羊抗兔IgG(上海艾博抗生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)和分組：復(fù)蘇細(xì)胞后，將A549細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。收集對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用花姜酮(花姜酮用10%的DMSO溶解，再用細(xì)胞培養(yǎng)液制成100 μmol/L母液，實(shí)驗(yàn)時配制所需濃度，DMSO體積分?jǐn)?shù)小于0.1%)終濃度分為5、10和20 μmol/L的細(xì)胞培養(yǎng)液孵育細(xì)胞48 h，依次記為花姜酮-低、中和高劑量組。同時設(shè)置對照組，給與0.1%的DMSO。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pcDNA、pcDNA-FBXW7分別轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，依次記為pcDNA組、pcDNA-FBXW7組。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將si-NC、si-FBXW7分別轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染成功后用花姜酮終濃度為20 μmol/L的細(xì)胞培養(yǎng)液孵育細(xì)胞48 h，依次記為花姜酮+si-NC組、花姜酮+si-FBXW7組。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖：將未轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞接種96孔板，貼壁后用含5、10、20 μmol/L花姜酮的細(xì)胞培養(yǎng)液(每孔100 μL)培養(yǎng)箱孵育48 h[5]，設(shè)置3個復(fù)孔；將轉(zhuǎn)染si-NC或轉(zhuǎn)染si-FBXW7的A549細(xì)胞接種96孔板，貼壁后用含20 μmol/L花姜酮的細(xì)胞培養(yǎng)液(每孔100 μL)培養(yǎng)箱孵育48 h，設(shè)置3個復(fù)孔；將轉(zhuǎn)染pcDNA或pcDNA-FBXW7的A549細(xì)胞接種96孔板，設(shè)置3個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。每孔加MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加DMSO 150 μL，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解。選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔吸光度(Absorbance，A)值。增殖抑制率=(1-A實(shí)驗(yàn)組/A對照組)×100%

1.2.3 Transwell小室法檢測細(xì)胞遷移和侵襲：用細(xì)胞培養(yǎng)液將Matrigel按1∶8稀釋，包被Transwell小室底部膜的上室面，室溫放置30 min使Matrigel聚合成凝膠，使用前進(jìn)行基底膜水化。消化各組細(xì)胞，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞至5×105/mL。取細(xì)胞懸液200 μL加入Transwell小室，24孔板下室加入600 μL含20%血清的培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液沖洗2次，甲醇固定30 min，將小室適當(dāng)風(fēng)干，用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，磷酸鹽緩沖液沖洗2次，顯微鏡下隨即5個視野觀察細(xì)胞，計(jì)數(shù)，以其均值表示細(xì)胞侵襲數(shù)量。遷移實(shí)驗(yàn)時采用未包被基質(zhì)膠的Transwell小室，其他步驟參考侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 實(shí)時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測FBXW7 mRNA相對表達(dá)量：使用Trizol試劑提取各組細(xì)胞的總RNA，然后測定每個RNA樣品濃度。利用一步法cDNA合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，利用SYBR Green Master Mix、特異性引物進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，以GAPDH為內(nèi)參照，2-ΔΔCt法分析FBXW7 mRNA相對表達(dá)量。FBXW7上游5′-CGTGGAATCAAACGAG ATCATCA-3′，下游5′-GCTTGTCCCAGTGGTGGATG T-3′；GAPDH上游5′-ATCCACGGGAGAGCGACAT-3′，下游5′-CAGCTGCTTGTAAAGTGGAC-3′。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)檢測FBXW7、cyclinD1、P21、MMP-2和MMP-9蛋白相對表達(dá)量：使用細(xì)胞裂解液對各組細(xì)胞進(jìn)行裂解，然后測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。在蛋白樣品中加入適量上樣緩沖液，沸水浴加熱3～5 min充分變性蛋白。冷卻后，將蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)，100 V恒壓電泳90 min，利用標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置300 mA轉(zhuǎn)膜30 min。轉(zhuǎn)膜完畢后，立即將膜置于TBST洗膜液中漂洗2 min，隨后將膜置于含5%脫脂牛奶的封閉液中室溫封閉1 h。用稀釋的一抗溶液孵育膜1 h。用TBST洗膜液側(cè)擺搖床洗膜10 min，共洗滌3次。用稀釋的二抗溶液室溫孵育膜1 h。用TBST洗膜液側(cè)擺搖床洗膜10 min，共洗滌3次。將膜置于ECL發(fā)光液中顯影、定影。凝膠成像系統(tǒng)對各條帶吸光度值進(jìn)行分析，目的蛋白相對表達(dá)量以目的蛋白和內(nèi)參GAPDH吸光度值比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組A549細(xì)胞的增殖

與對照組比較，花姜酮低、中和高劑量組A549細(xì)胞增殖抑制率(IC50為11.83 μmol/L)、顯著升高(P<0.05)；與pcDNA組比較，pcDNA-FBXW7組A549細(xì)胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05)；與花姜酮-高劑量+si-NC組比較，花姜酮-高劑量+si-FBXW7組A549細(xì)胞增殖抑制率顯著降低(P<0.05)(表1)。

表1 各組A549細(xì)胞的增殖Table 1 Proliferation of A549 cells in each group

2.2 各組A549細(xì)胞的遷移和侵襲

與對照組比較，花姜酮低、中和高劑量組A549細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)顯著減少(P<0.05)；與pcDNA組比較，pcDNA-FBXW7組A549細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)顯著減少(P<0.05)；與花姜酮-高劑量+si-NC組比較，花姜酮-高劑量+si-FBXW7組A549細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.05)(表2，圖1)。

圖1 各組A549細(xì)胞的遷移和侵襲Fig 1 Migration and invasion of A549 cells in each group

表2 各組A549細(xì)胞的遷移和侵襲Table 2 Migration and invasion of A549 cells in each

2.3 各組A549細(xì)胞FBXW7 mRNA相對表達(dá)量

與對照組比較，花姜酮低、中和高劑量組A549細(xì)胞FBXW7 mRNA表達(dá)量顯著增加(P<0.05)；與pcDNA組比較，pcDNA-FBXW7組A549細(xì)胞FBXW7 mRNA表達(dá)量顯著增加(P<0.05)；與花姜酮-高劑量+si-NC組比較，花姜酮-高劑量+si-FBXW7組A549細(xì)胞FBXW7 mRNA表達(dá)量顯著減少(P<0.05)(表3)。

表3 各組A549細(xì)胞FBXW7 mRNA相對表達(dá)量Table 3 Relative expression levels of FBXW7 mRNA in A549 cells in each

2.4 各組細(xì)胞FBXW7、CyclinD1、P21、MMP-2和MMP-9蛋白相對表達(dá)量

與對照組比較，花姜酮低、中和高劑量組A549細(xì)胞FBXW7、p21蛋白表達(dá)顯著升高，cyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與pcDNA組比較，pcDNA-FBXW7組A549細(xì)胞p21蛋白表達(dá)顯著升高，cyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與花姜酮-高劑量+si-NC組比較，花姜酮-高劑量+si-FBXW7組A549細(xì)胞p21蛋白表達(dá)顯著降低，cyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)(圖2，表4)。

表4 各組細(xì)胞FBXW7、cyclinD1、p21、MMP-2和MMP-9蛋白相對表達(dá)量Table 4 Relative expression levels of FBXW7,cyclinD1,P21,MMP-2 and MMP-9 proteins in each

圖2 各組細(xì)胞FBXW7、cyclinD1、p21、MMP-2和MMP-9蛋白相對表達(dá)量Fig 2 Relative expression levels of FBXW7,cyclinD1,p21,MMP-2 and MMP-9 proteins in each group

3 討論

姜是一種廣泛使用的藥食兩用植物，具有解表散寒、溫中止嘔等功效?；ń菑慕刑崛〉闹饕钚猿煞郑渫ㄟ^調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移侵襲、放化療耐藥顯示出顯著的抗腫瘤作用，是腫瘤治療的潛在候選藥物?；ń赡芡ㄟ^上調(diào)P53、下調(diào)B細(xì)胞淋巴瘤2(B cell lymphoma 2，Bcl-2)基因表達(dá)抑制食管癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。花姜酮通過激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信號通路抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移潛能[7]。此外，花姜酮還可調(diào)節(jié)放射治療后腫瘤細(xì)胞DNA的修復(fù)反應(yīng)，提高前列腺癌的輻射敏感性[8]。本研究探討花姜酮在NSCLC中作用發(fā)現(xiàn)，花姜酮呈劑量依賴效應(yīng)抑制A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。與本研究類似，花姜酮可抑制骨橋蛋白誘導(dǎo)的A549細(xì)胞侵襲[9]。CyclinD1和P21是經(jīng)典的增殖相關(guān)基因，cyclinD1表達(dá)增加可促進(jìn)細(xì)胞周期向S期推進(jìn)發(fā)揮促增殖作用，P21則通過阻止細(xì)胞周期依賴蛋白激酶和cyclinD1形成復(fù)合物發(fā)揮抗增殖作用[10]。MMP-2和MMP-9是經(jīng)典的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，其通過降解細(xì)胞外基質(zhì)在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮促進(jìn)作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)花姜酮以劑量依賴方式降低cyclinD1、MMP-2和MMP-9表達(dá)水平，提高P21表達(dá)水平，與功能分析相一致，這進(jìn)一步說明花姜酮對NSCLC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。

FBXW7蛋白是泛素連接酶的重要組成成分之一，其通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解促癌蛋白(c-Myc、cyclin E和c-JUN)參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖，是一種有效的腫瘤抑制因子。研究顯示，NSCLC組織中FBXW7表達(dá)降低，F(xiàn)BXW7低表達(dá)與晚期臨床病理分期、5年生存率較差有關(guān)[12]。過表達(dá)FBXW7通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、增加化學(xué)敏感性和抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程來抑制NSCLC的進(jìn)展[13]。本研究顯示，花姜酮處理后A549細(xì)胞中FBXW7呈劑量依賴性增加，提示花姜酮可能通過調(diào)控FBXW7表達(dá)在NSCLC中發(fā)揮抗腫瘤作用。過表達(dá)FBXW7后A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力顯著降低，cyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)降低，P21表達(dá)增加，與報道相一致[14]。進(jìn)一步恢復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示，干擾FBXW7表達(dá)還可逆轉(zhuǎn)花姜酮對A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲抑制作用，進(jìn)一步說明花姜酮通過上調(diào)FBXW7表達(dá)抑制A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，本研究證實(shí)花姜酮能夠抑制NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，其機(jī)制與上調(diào)FBXW7表達(dá)有關(guān)，這為花姜酮用于防治NSCLC奠定了理論依據(jù)。