熊玉圓，陳德杰，孟 琳，晏 珊

(湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院 襄陽市中心醫(yī)院，湖北 襄陽 441021)

乳腺癌(breast cancer)是發(fā)生于乳腺導(dǎo)管上皮的惡性腫瘤[1]。全球每年約208萬例新診斷病例，有62.6多萬例死亡病例[2]。Tousled樣激酶2(tousled like kinase 2,TLK2)是絲氨酸-蘇氨酸激酶家族成員之一，與各種生物體中的DNA復(fù)制、DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)等有關(guān)[3]。TLK在人類惡性腫瘤進展中頻繁擴增，成為癌治療的潛在靶標(biāo)[4]。例如，TLK2被鑒定為治療結(jié)直腸癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的潛在生物標(biāo)志物[3,5]。已有報道TLK2與乳腺癌風(fēng)險增加相關(guān)聯(lián)[6]。Targetscan在線分析數(shù)據(jù)庫提示，TLK2和miR-622之間存在潛在的結(jié)合位點。本研究旨在探索TLK2在乳腺癌中的表達、TLK2對乳腺癌細(xì)胞惡性表型的影響及其相關(guān)機制。本研究初步證實了miR-622/TLK2軸參與調(diào)控HCC70細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，為乳腺癌的診斷和治療提供了新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料：從接受腫瘤切除術(shù)的患者中收集52例乳腺癌患者的病理組織標(biāo)本及鄰近組織，立即存儲在-80 ℃冰箱中。所有患者經(jīng)術(shù)后組織病理檢查明確診斷。本研究獲得所有患者知情同意和襄陽市中心醫(yī)院研究倫理委員會批準(zhǔn)(XY20180501009)。

1.1.2 細(xì)胞與試劑：人正常乳腺上皮細(xì)胞系(MCF-10A細(xì)胞)和乳腺癌細(xì)胞系(HCC70、MCF-7細(xì)胞)(中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所)；miR-control、miR-622抑制劑、空載質(zhì)粒、過表達TLK2質(zhì)粒(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；RPMI1640培養(yǎng)基、牛血清和青霉素/鏈霉素(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；LipofectamineTM3000、Trizol試劑(Invitrogen公司)；PrimeScript RT Master Mix Kit(TaKaRa Bio公司)；引物序列(Genecopoeia 公司)；CCK-8試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)；BrdU抗體、抗TLK2(Abcam公司)；辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗(武漢博士德生物工程有限公司)；Transwell小室、脫脂牛奶、PVDF膜(Millipore公司)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒 (Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)和分組處理：將MCF-10A細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2～3 d更換培養(yǎng)液。待細(xì)胞接近80%匯合時用0.25%胰蛋白酶消化傳代。將細(xì)胞接種于12孔板，每孔細(xì)胞為1×106個，分為3組：對照組細(xì)胞正常培養(yǎng)，過表達TLK2組及轉(zhuǎn)染miR-622抑制劑組。

1.2.2 免疫組織化學(xué)法檢測組織中TLK2的表達:臨床標(biāo)本在10%甲醛中固定、包埋、脫蠟和水化。用1% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物5 min,PBS洗3次，免疫染色封閉液封閉1 h，之后用羊抗兔抗體(1∶200)孵育4 ℃過夜。PBS洗滌切片，然后用生物素標(biāo)記的抗血清室溫下孵育1 h。再次洗滌切片，DAB著色1 min，蘇木精染色1 min，在顯微鏡下觀察。

1.2.3 RT-qPCR檢測TLK2 mRNA和miR-622的表達：利用Trizol試劑提取總RNA，然后使用轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用SYBRGreen法，以cDNA為模板，利用miR-622和TLK2特異性引物進行PCR擴增。對每組樣品進行一式3份定量PCR檢測。使用2-ΔΔCt方法計算miR-622和TLK2 mRNA相對表達量。PCR進行的條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min，然后在95 ℃下變性15 s，在60 ℃下退火30 s。引物序列如下：TLK2：5′-ACTAGCGCAAAGG AACTCAATGTG-3′ (上游引物)，5′-CCAGACCAG GCAAGACTCAGAC-3′ (下游引物)；miR-622:5′-ATCCCAGGGAGACAGAGATCGAGG-3′(上游引物),5′-AA GCTTGGTGGTGGACTTTTGGTTGT-3′ (下游引物)；GAPDH：5′-CTCCTCCACCTTTGACGCTG-3′ (上游引物),5′-TCCTCTTGTGCTCTTGCTGG-3′ (下游引物);U6:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′(上游引物),5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′(下游引物)。

1.2.4 Western blot檢測細(xì)胞中TLK2的表達：用RIPA提取MCF-10A、HCC70、MCF-7細(xì)胞中總蛋白。BCA法測定蛋白濃度后，采用SDS-PAGE分離總蛋白后轉(zhuǎn)至 PVDF 膜上。將膜用5%脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃孵育一抗(1∶1 000)過夜。次晨采用TBST漂洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶1 000)37 ℃孵育1 h，ECL顯影。

1.2.5 CCK-8法檢測HCC70細(xì)胞增殖：按照約2×103個細(xì)胞/孔接種于96孔板，培養(yǎng)1、2、3、4和5 d后取出，加入10 μL/孔CCK-8試劑后繼續(xù)孵育2 h。于酶標(biāo)儀450 nm波長下檢測每孔吸光度值。

1.2.6 BrdU摻入實驗：將HCC70細(xì)胞(2×103個/mL)接種于24孔板中。當(dāng)細(xì)胞匯合至80%時加入10 μmol/L BrdU。將細(xì)胞DNA經(jīng)變性處理后加BrdU一抗(1∶300)，常溫孵育2 h。加入熒光二抗常溫孵育2 h，用DAPI復(fù)染細(xì)胞核后，在熒光顯微鏡下進行觀察。隨機選擇10個非重疊視野。計算BrdU陽性細(xì)胞數(shù)，取其平均值。

1.2.7 Transwell小室法評估HCC70細(xì)胞遷移和侵襲的能力：在侵襲實驗中，將Matrigel基質(zhì)膠加入Transwell小室中。在Transwell小室上室加入含胎牛血清的培養(yǎng)基，下室加入含有胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基。37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，甲醇固定下室中的細(xì)胞并用0.1%結(jié)晶紫染色，在倒置顯微鏡下拍照，顯微鏡下觀察穿膜細(xì)胞數(shù)，計數(shù)中間及四周5個高倍鏡下視野細(xì)胞數(shù)，計算平均數(shù)。遷移實驗，除在Transwell小室內(nèi)未加入Matrigel外，其他步驟與侵襲實驗相同。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒簩⒑幸吧图巴蛔冃蚑LK2的片段分別整合入pGL3 vector。將上述片段分別與miR-622模擬物或陰性對照物共轉(zhuǎn)染HCC70細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，按照制造商的說明測定熒光素酶活性。所有實驗一式3份，重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TLK2在乳腺癌組織和細(xì)胞中高表達

乳腺癌組織和癌旁組織免疫組化染色代表圖(圖1A)。癌旁組織中有31例陰性表達，21例陽性表達。乳腺癌組織中有19例陰性表達，33例陽性表達。統(tǒng)計結(jié)果提示TLK2在腫瘤組織中陽性率顯著增加(圖1B)(P<0.05)。GEPIA數(shù)據(jù)庫提示TLK2在乳腺癌中高表達(圖1C)。其次，與鄰近的非腫瘤組織相比，乳腺癌組織中TLK2 mRNA的表達顯著上調(diào)(圖1D)(P<0.001)。另外，與MCF-10A細(xì)胞相比，兩種乳腺癌細(xì)胞中TLK2在mRNA和蛋白水平也顯著上調(diào)(圖 1E，F(xiàn))(P<0.05)。

A.immunohistochemical was used to detect the expression of TLK2 in breast cancer tissues and adjacent tissues (n=52);B.positive cases and negative cases of TLK2 expression in breast cancer tissues and adjacent tissues were counted;C.expression of TLK2 in breast cancer tissues and normal tissues was analyzed by GEPIA database;D,E.expression of TLK2 in breast cancer tissues (n=52)and cell lines (n=3)was detected by RT-qPCR;F.expression of TLK2 protein in the cell line was detected by Western blot (n=3);*P<0.01,**P<0.001 compared with control圖1 TLK2在乳腺癌組織和細(xì)胞中高表達Fig 1 TLK2 was highly expressed in breast cancer tissues and cells n=3)

2.2 TLK2促進HCC70細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

隨后成功構(gòu)建過表達TLK2細(xì)胞模型(圖2A)(P<0.001)。與對照組相比，過表達TLK2顯著促進HCC70細(xì)胞增殖(圖2B，C)(P<0.05)和遷移及侵襲(圖2D，E)(P<0.01)。

A.overexpressing TLK2 plasmid was successfully transfected into HCC70 cells;B,C.cell viability was detected by CCK-8 and BrdU assay(×100);D,E.migration and invasion were detected by Transwell assay(×200);*P<0.05,**P<0.01；***P<0.001 compared with control圖2 TLK2促進HCC70細(xì)胞增殖、遷移和侵襲Fig 2 TLK2 promotes the proliferation,migration and invasion of HCC70 cells

2.3 miR-622在乳腺癌組織和細(xì)胞系中低表達

與癌旁組織相比，miR-622在乳腺癌組織中的表達水平下調(diào)(圖3A)(P<0.001)。此外與MCF-10A細(xì)胞相比，miR-622在乳腺癌細(xì)胞系中的表達水平顯著降低(圖3B)(P<0.05)。

A.expression level of miR-622 in breast cancer tissue was detected by RT-qPCR (n=52);B.expression of miR-622 in normal human breast epithelial cell lines and human breast cancer cell lines were detected by RT-qPCR(n=3);*P<0.05,**P<0.001 compared with control圖3 miR-622在乳腺癌組織和細(xì)胞中低表達Fig 3 Expression level of miR-622 in breast cancer was significantly reduced

2.4 抑制miR-622的表達顯著促進HCC70細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

進一步將miR-con和miR-622抑制劑分別轉(zhuǎn)染HCC70細(xì)胞(圖4A)(P<0.001)。抑制miR-622的表達能顯著促進HCC70細(xì)胞增殖、遷移和侵襲(圖 4B～E)(P<0.05)。

A.miR-622 inhibitors were successfully transfected into HCC70 cells (n=3);B,C.cell proliferation was detected by CCK-8 and BrdU experiments(×100);D,E.migration and invasion were detected by Transwell experiments(×200);*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with control圖4 miR-622抑制劑促進HCC70細(xì)胞增殖、遷移和侵襲Fig 4 miR-622 inhibitors promote HCC70 cell proliferation,migration and invasion

2.5 miR-622是TLK2的上游靶標(biāo)

Targetscan分析表明miR-622和TLK2之間的結(jié)合位點(圖5A)。進一步，miR-622抑制劑能夠顯著促進TLK2在蛋白和mRNA水平的表達(圖5B,C)。進一一步，miR-622能夠顯著降低野生型TLK2的熒光素酶活性，但不能顯著降低突變型TLK2的熒光素酶活性(圖 5D)。此外，miR-622負(fù)向調(diào)控TLK2的表達水平(圖 5E)。

A.binding site between miR-622 and TLK2 was predicted by TargetScan;B,C.after breast cancer cells were transfected with miR-622 inhibitors,the expression level of TLK2 was detected by Western blot and RT-qPCR (n=3);D.interaction between miR-622 and TLK2 was verified by luciferase reporter gene (n=3);E.correlation between miR-622 and TLK2 expression level was analyzed by Pearson (n=52);*P<0.05,**P<0.001 compared with control圖5 miR-622靶向調(diào)控TLK2Fig 5 miR-622 targets and regulates TLK2

3 討論

TLK2不僅是許多生物體內(nèi)維持基因組穩(wěn)定和正常發(fā)育所必需的，而且與腫瘤的發(fā)生緊密相關(guān)[7]。例如，TLK2沉默導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在G2/M期，最終誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡[3]。此外，TLK2通過激活下游的SRC從而促進膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的惡性表型和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[3]。TLK2沉默通過下調(diào)ERα、BCL2和SKP2，從而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。TLK2的擴增和過度表達干擾Chk1/2誘導(dǎo)的DNA損傷檢查點信號，導(dǎo)致細(xì)胞周期G2/M檢查點異常，DNA修復(fù)過程延遲，染色體穩(wěn)定性變差,從而誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生[8]。本研究中，TLK2在乳腺癌組織和細(xì)胞系中高表達，從而促進乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

miRNA是短鏈非編碼RNA，在惡性腫瘤進展中起著至關(guān)重要的作用，它通過與靶基因特異性結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)基因的表達[9]。已有報道指出miR-622參與抑制多種腫瘤進展。例如，miR-622的下調(diào)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的病理分級增高和總體生存率低有關(guān)。miR-622的過表達顯著抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，同時在體外抑制ZEB2的表達從而促進細(xì)胞凋亡[9]。miR-622通過靶向CCL18抑制腎癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[10]。miR-622通過靶向ING1、HIF-1α、MAP4K4、YAP1和RB1充當(dāng)腫瘤的抑制因子，然而miR-622直接靶向DYRK2在結(jié)直腸癌中充當(dāng)原癌基因[11]。這些研究表明miR-622產(chǎn)生的效應(yīng)和腫瘤特異性有關(guān)。miR-622通過直接靶向RNF8 3′-UTR抑制RNF8表達，miR-622與乳腺癌之間存在潛在的相關(guān)性[12]。本研究結(jié)果表明，與對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-622抑制劑后顯著促進乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，這提示miR-622在乳腺癌中發(fā)揮抑癌作用。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-622與TLK2之間存在結(jié)合位點。本研究發(fā)現(xiàn)與對照組相比，miR-622抑制劑顯著促進了TLK2在蛋白和mRNA水平的表達。進一步雙熒光素酶基因報告實驗結(jié)果提示miR-622可以結(jié)合TLK2的3′UTR。上述結(jié)果表明，miR-622/TLK2軸參與乳腺癌的進展。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)TLK2作為促癌因子在乳腺癌組織及細(xì)胞中高表達。TLK2促進乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。此外，miR-622是負(fù)向調(diào)控TLK2表達的上游分子。TLK2可能成為治療BC的新生物標(biāo)志物。