X線放射誘導大鼠心肌細胞系H9c2損傷中組蛋白乙?；浇档?/h1>
2021-08-16 07:24:56張正義盧昌宏孫鵬飛張德奎
基礎醫(yī)學與臨床 2021年8期
蒙 穎，張正義，趙 嫄，盧昌宏，商 波，孫鵬飛，張德奎
(蘭州大學第二醫(yī)院 1.全科醫(yī)學科；2.放療科；3.消化內(nèi)科，甘肅 蘭州 730030)
放射治療是多種惡性腫瘤的有效治療方法，但胸部放射治療引起的心血管功能障礙損害了癌癥幸存者的長期健康[1]。研究顯示，與未接受放射治療患者相比，接受胸部放療的患者發(fā)生心血管疾病的風險及心源性死亡率均明顯升高[2-3]。電離輻射通過活組織時會產(chǎn)生活性氧類物質(zhì)，其會誘導細胞損傷和凋亡，這與放射誘導的心臟疾病密切相關[4]。
組蛋白乙?；潜碛^遺傳修飾中特征性翻譯后修飾之一，在調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構和基因表達中起關鍵作用[5]。研究表明，組蛋白乙?；礁淖兣c多種心血管疾病密切相關[6-7]，然而關于輻射暴露后心肌的表觀遺傳學改變卻少有報道，本研究觀察輻射暴露后心肌細胞損傷及組蛋白乙?；?，分析其之間的相關性并探討其調(diào)控機制。
1 材料與方法
1.1 材料
大鼠源心肌細胞系H9c2(廣州賽庫生物技術有限公司)；乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)活性檢測試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量檢測試劑盒及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；FITC annexin V凋亡檢測試劑盒(BD公司)；鼠抗caspase-3抗體(圣克魯斯生物科技公司)；兔抗H3K9ac抗體(賽信通公司)；兔抗Bcl-2抗體、兔抗HDAC3抗體、兔抗GAPDH抗體及兔抗β-tublin抗體(武漢三鷹生物技術有限公司)；Synergy直線加速器(瑞典醫(yī)科達公司)。
1.2 方法
1.2.1 H9c2細胞的分組及處理：常規(guī)培養(yǎng)H9c2細胞，匯合度達80%～90%后分為對照組和放射組，放射組采用Synergy直線加速器6MV-X線，劑量率為200 MU/min，照射劑量分別為2、4、6和8 Gy，垂直于細胞貼壁面，距離100 cm 進行照射，照射后繼續(xù)正常培養(yǎng)，48 h后進行后續(xù)實驗。
1.2.2 細胞上清液中LDH活性的檢測：取對照組及各放射組培養(yǎng)細胞上清液，嚴格按照LDH檢測試劑盒說明書進行操作。
1.2.3 流式細胞測量術檢測細胞凋亡率：將對照組及各放射組細胞洗滌，消化后重懸細胞，調(diào)整細胞為1×106/mL，加入annexin V 和PI 工作液，混勻，避光靜置 15 min,用流式細胞儀進行檢測，測定細胞凋亡率。
1.2.4 細胞中MDA含量及SOD活性的檢測：收集各組細胞，嚴格按照MDA、SOD檢測試劑盒說明書進行操作。
1.2.5 Western blot 檢測凋亡及組蛋白乙?；嚓P蛋白：對各組細胞進行洗滌后裂解，提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，上樣，SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，洗膜，封閉，分別加入caspase-3、Bcl-2、乙?；M蛋白H3(H3K9)，HDAC3抗體孵育，4 ℃過夜;TBST漂洗后加入相應二抗孵育2 h，再次TBST漂洗后用化學發(fā)光顯色液進行曝光，用圖像分析軟件分析吸光度值。
1.3 統(tǒng)計學分析
2 結(jié)果
2.1 X線對H9c2細胞LDH釋放的影響
H9c2細胞培養(yǎng)上清中，放射組較對照組LDH活性比值呈劑量依賴性增大(P<0.05)(圖1)。
*P<0.05 compared with control group圖1 X線照射后H9c2細胞培養(yǎng)上清LDH活性變化Fig 1 The activity of LDH in H9c2 cell medium after
2.2 X線對H9c2 細胞凋亡率的影響
與對照組相比，放射組H9c2細胞凋亡率呈劑量依賴性升高(P<0.05)(圖2)。
2.3 X線對H9c2 細胞氧化應激的影響
在H9c2細胞中，放射組MDA含量較對照組呈劑量依賴性增加(P<0.05)；而SOD活性呈劑量依賴性減少(P<0.05)(圖3)。
A.content of MDA in H9c2 cells;B.activity of SOD in H9c2 cells;*P<0.05 compared with control group圖3 X線照射對H9c2細胞氧化應激的影響Fig 3 Effect of X-irradiation on oxidative stress of H9c2
2.4 X線對H9c2 細胞凋亡相關蛋白的影響
與對照組相比，放射組H9c2細胞中caspase3表達明顯增加，而Bcl-2表達明顯降低(P<0.05)，且在8 Gy組上述變化最為明顯(圖4)。
A.expression of Bcl-2 and caspase3 in H9c2 cells of each group;B.difference of the relative expression of Bcl-2 in each groups;C.difference of the relative expression of caspase3 in each groups；*P<0.05 compared with control group圖4 X線照射對凋亡相關蛋白表達的影響Fig 4 Effect of X-irradiation on the expression of apoptosis associated
2.5 各組細胞中HDAC3蛋白及組蛋白乙?；?/h3>
與對照組相比，放射組H9c2細胞中HDAC3表達增加，而組蛋白H3乙酰化水平降低(P<0.05)，且在8 Gy組上述變化最為明顯(圖5)。
A.expression of H3K9ac and HDAC3 in H9c2 cells of each group;B.difference of the relative expression of H3K9ac in each groups;C.difference of the relative expression of HDAC3 in each groups；*P<0.05 compared with control group圖5 X線照射對組蛋白乙?；嚓P蛋白表達的影響Fig 5 Effect of X-irradiation on the expression of histone acetylation associated
3 討論
氧化應激與放射性心臟病密切相關，此過程中會形成脂質(zhì)過氧化并伴隨抗氧化酶活力變化，本研究通過檢測脂質(zhì)過氧化標志物MDA及抗氧化酶SOD顯示，與對照組相比，輻射暴露后H9c2細胞中MDA含量增加，SOD活性降低，提示氧化應激作用增強。氧化應激破壞細胞內(nèi)大分子結(jié)構，導致細胞損傷，甚至凋亡[8-9]，而心肌細胞發(fā)生損傷后會釋放大量LDH至細胞外。本研究結(jié)果顯示與對照組相比，放射組H9c2細胞培養(yǎng)上清中LDH活性增高，提示H9c2細胞發(fā)生損傷，同時通過檢測細胞凋亡率發(fā)現(xiàn)放射條件下H9c2細胞凋亡明顯增加。半胱天冬酶3 (cysteinyl aspartic acid protease-3，caspase-3)是細胞凋亡調(diào)控中的關鍵效應蛋白，Bcl-2是代表性的抗凋亡因子。本研究進一步檢測上述因子蛋白表達發(fā)現(xiàn)，在放射組H9c2細胞中caspase-3表達升高，Bcl-2表達下降，提示凋亡調(diào)節(jié)失衡在X線輻射誘導H9c2細胞凋亡中發(fā)揮作用。
A.control group；B.2 Gy group；C.4 Gy group；D.6 Gy group;E.8 Gy group；F.graph of cell apoptosis rate；*P<0.05 compared with control group圖2 X線照射對H9c2細胞凋亡的影響Fig 2 Effect of X-irradiation on apoptosis of H9c2
表觀遺傳修飾可通過影響基因表達參與疾病過程，已有研究表明，表觀遺傳機制中的DNA甲基化、miRNA與輻射損傷相關[10-11]，而在皮膚損傷相關研究中顯示輻射暴露可使人角質(zhì)形成細胞內(nèi)的組蛋白乙?；斤@著降低[12]。組蛋白去乙?；?(histone deacetylases，HDAC)是乙酰化調(diào)節(jié)酶之一，可清除組蛋白乙?；痆13]，針對HDAC 家族中HDAC3的研究表明，在脂多糖致心肌細胞損傷中HDAC3在氧化應激作用下活性明顯增加[14]。本研究結(jié)果顯示，放射組H9c2細胞中乙?；M蛋白H3表達降低伴隨HDAC3表達增高，表明放射誘導的H9c2細胞損傷中組蛋白呈現(xiàn)低乙酰化狀態(tài)，并提示HDAC3可能是放射后H9c2細胞組蛋白乙酰化過程減弱的主要調(diào)節(jié)因子，而同時升高的氧化應激水平也提示放射后HDAC3表達增加可能通過氧化應激被誘導。
綜上，放射誘導的心肌細胞損傷中伴隨組蛋白乙?；浇档停鳫DAC3可能是調(diào)節(jié)這一過程中組蛋白乙?；潭鹊闹饕蜃??；贖DAC的組蛋白乙?；{(diào)控可能為放射性心臟病的治療提供新的思路。
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組蛋白乙?；潜碛^遺傳修飾中特征性翻譯后修飾之一，在調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構和基因表達中起關鍵作用[5]。研究表明，組蛋白乙?；礁淖兣c多種心血管疾病密切相關[6-7]，然而關于輻射暴露后心肌的表觀遺傳學改變卻少有報道，本研究觀察輻射暴露后心肌細胞損傷及組蛋白乙?；?，分析其之間的相關性并探討其調(diào)控機制。
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1.2.2 細胞上清液中LDH活性的檢測：取對照組及各放射組培養(yǎng)細胞上清液，嚴格按照LDH檢測試劑盒說明書進行操作。
1.2.3 流式細胞測量術檢測細胞凋亡率：將對照組及各放射組細胞洗滌，消化后重懸細胞，調(diào)整細胞為1×106/mL，加入annexin V 和PI 工作液，混勻，避光靜置 15 min,用流式細胞儀進行檢測，測定細胞凋亡率。
1.2.4 細胞中MDA含量及SOD活性的檢測：收集各組細胞，嚴格按照MDA、SOD檢測試劑盒說明書進行操作。
1.2.5 Western blot 檢測凋亡及組蛋白乙?；嚓P蛋白：對各組細胞進行洗滌后裂解，提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，上樣，SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，洗膜，封閉，分別加入caspase-3、Bcl-2、乙?；M蛋白H3(H3K9)，HDAC3抗體孵育，4 ℃過夜;TBST漂洗后加入相應二抗孵育2 h，再次TBST漂洗后用化學發(fā)光顯色液進行曝光，用圖像分析軟件分析吸光度值。
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*P<0.05 compared with control group圖1 X線照射后H9c2細胞培養(yǎng)上清LDH活性變化Fig 1 The activity of LDH in H9c2 cell medium after
2.2 X線對H9c2 細胞凋亡率的影響
與對照組相比，放射組H9c2細胞凋亡率呈劑量依賴性升高(P<0.05)(圖2)。
2.3 X線對H9c2 細胞氧化應激的影響
在H9c2細胞中，放射組MDA含量較對照組呈劑量依賴性增加(P<0.05)；而SOD活性呈劑量依賴性減少(P<0.05)(圖3)。
A.content of MDA in H9c2 cells;B.activity of SOD in H9c2 cells;*P<0.05 compared with control group圖3 X線照射對H9c2細胞氧化應激的影響Fig 3 Effect of X-irradiation on oxidative stress of H9c2
2.4 X線對H9c2 細胞凋亡相關蛋白的影響
與對照組相比，放射組H9c2細胞中caspase3表達明顯增加，而Bcl-2表達明顯降低(P<0.05)，且在8 Gy組上述變化最為明顯(圖4)。
A.expression of Bcl-2 and caspase3 in H9c2 cells of each group;B.difference of the relative expression of Bcl-2 in each groups;C.difference of the relative expression of caspase3 in each groups；*P<0.05 compared with control group圖4 X線照射對凋亡相關蛋白表達的影響Fig 4 Effect of X-irradiation on the expression of apoptosis associated
2.5 各組細胞中HDAC3蛋白及組蛋白乙?；?/h3>
與對照組相比，放射組H9c2細胞中HDAC3表達增加，而組蛋白H3乙酰化水平降低(P<0.05)，且在8 Gy組上述變化最為明顯(圖5)。
A.expression of H3K9ac and HDAC3 in H9c2 cells of each group;B.difference of the relative expression of H3K9ac in each groups;C.difference of the relative expression of HDAC3 in each groups；*P<0.05 compared with control group圖5 X線照射對組蛋白乙?；嚓P蛋白表達的影響Fig 5 Effect of X-irradiation on the expression of histone acetylation associated
3 討論
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A.control group；B.2 Gy group；C.4 Gy group；D.6 Gy group;E.8 Gy group；F.graph of cell apoptosis rate；*P<0.05 compared with control group圖2 X線照射對H9c2細胞凋亡的影響Fig 2 Effect of X-irradiation on apoptosis of H9c2
表觀遺傳修飾可通過影響基因表達參與疾病過程，已有研究表明，表觀遺傳機制中的DNA甲基化、miRNA與輻射損傷相關[10-11]，而在皮膚損傷相關研究中顯示輻射暴露可使人角質(zhì)形成細胞內(nèi)的組蛋白乙?；斤@著降低[12]。組蛋白去乙?；?(histone deacetylases，HDAC)是乙酰化調(diào)節(jié)酶之一，可清除組蛋白乙?；痆13]，針對HDAC 家族中HDAC3的研究表明，在脂多糖致心肌細胞損傷中HDAC3在氧化應激作用下活性明顯增加[14]。本研究結(jié)果顯示，放射組H9c2細胞中乙?；M蛋白H3表達降低伴隨HDAC3表達增高，表明放射誘導的H9c2細胞損傷中組蛋白呈現(xiàn)低乙酰化狀態(tài)，并提示HDAC3可能是放射后H9c2細胞組蛋白乙酰化過程減弱的主要調(diào)節(jié)因子，而同時升高的氧化應激水平也提示放射后HDAC3表達增加可能通過氧化應激被誘導。
綜上，放射誘導的心肌細胞損傷中伴隨組蛋白乙?；浇档停鳫DAC3可能是調(diào)節(jié)這一過程中組蛋白乙?；潭鹊闹饕蜃??；贖DAC的組蛋白乙?；{(diào)控可能為放射性心臟病的治療提供新的思路。
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