張傳西，張 宇，郭莎莎，厲 菁，袁義強(qiáng)，王明杰

(鄭州市第七人民醫(yī)院 心內(nèi)科，河南 鄭州 450000)

血脂異常是指體內(nèi)脂蛋白代謝異常，與動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)關(guān)系密切，且是冠心病和缺血性腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。頸動(dòng)脈粥樣硬化(carotid atherosclerosis，CAS)是全身動(dòng)脈粥樣硬化在頸動(dòng)脈的表現(xiàn)，以頸動(dòng)脈內(nèi)膜灶性纖維增厚及粥樣斑塊形成為主要病理表現(xiàn)，可導(dǎo)致頸動(dòng)脈管腔狹窄、變硬[1]。頸動(dòng)脈是顱腦重要供血通道，CAS發(fā)生后可增加腦梗死風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)社會(huì)及醫(yī)療機(jī)構(gòu)造成極大的負(fù)擔(dān)[2]。因此，了解血脂異常患者發(fā)生CAS的危險(xiǎn)因素，以及時(shí)采取針對(duì)性的措施，對(duì)防止CAS的發(fā)生與進(jìn)展具有重要意義。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的單鏈成熟內(nèi)源性非編碼小分子RNA，可調(diào)控細(xì)胞多種生物學(xué)功能，參與脂質(zhì)代謝、血管生成、自身免疫及炎性反應(yīng)等活動(dòng)，成為各類疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究熱點(diǎn)[3]。AS的發(fā)生受多種miRNA的調(diào)控，如miR-188b、miR-27a能夠影響細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出，參與AS的發(fā)展[4-5]。目前關(guān)于miRNA與AS發(fā)生機(jī)制的相關(guān)研究較多，但關(guān)于其在血清中的表達(dá)情況及對(duì)CAS預(yù)測(cè)作用研究較少。故本研究通過(guò)調(diào)查血脂異?；颊哐逯衜iR-181b、miR-27a的表達(dá)情況分析與CAS病變程度的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 資料

選取2018年3月至2019年12月體檢的血脂異?；颊?02例，均符合《中國(guó)成人血脂異常防治指南(2016年修訂版)》[6]對(duì)血脂異常的診斷，入院前服用影響血脂代謝相關(guān)藥物，其中男56名，女46名，年齡28～82歲，平均(43.6±12.8)歲。另選取健康人100例為對(duì)照組，其中男52名，女48名，年齡25～80歲，平均(42.9±12.5)歲。兩組性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。研究在實(shí)施前已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批號(hào)：2017021)，納入研究者對(duì)本次研究?jī)?nèi)容均知情同意，并簽署同意書(shū)。

RNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；Prime ScriPtTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaqMan公司)；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quanti-tative polymerase chain reaction，RT-qPCR)檢測(cè)試劑盒(ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR檢測(cè)血清miR-181b、miR-27a相對(duì)表達(dá)量：抽取受試著空腹肘靜脈血4 mL，抗凝試管中室溫靜置2 h，3 500 r/min離心10 min，離心半徑10 cm，分離上層血清，保存于-20 ℃待檢。以實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-181b、miR-27a mRNA相對(duì)表達(dá)量，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)定反應(yīng)體系及反應(yīng)條件，以U6為內(nèi)參，2-△△Ct為目的基因相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。

1.2.2 CAS的診斷、嚴(yán)重程度的判斷及分組：使用LOGIO E9彩色多普勒超聲儀，探頭頻率5～10 MHz，從頸動(dòng)脈近心端向遠(yuǎn)心端檢測(cè)雙側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸動(dòng)脈分叉處，觀察有無(wú)斑塊、內(nèi)部回聲，記錄斑塊形態(tài)、大小、內(nèi)膜回聲并檢測(cè)頸動(dòng)脈內(nèi)膜-中層厚度(intima-media thickness，IMT)。以IMT≥1.2 mm，超聲檢查局部有粥樣硬化斑塊或團(tuán)塊回聲增強(qiáng)且附著于管壁、管壁不均勻增厚則診斷為CAS[7]。以Crouse積分評(píng)估CAS的嚴(yán)重程度，Crouse積分不考慮斑塊長(zhǎng)度，以雙側(cè)頸動(dòng)脈各個(gè)孤立性粥樣硬化斑塊的最大厚度相加為Crouse積分，分?jǐn)?shù)越高則CAS病變程度越嚴(yán)重[8]。將符合CAS診斷標(biāo)準(zhǔn)者納入硬化組，否則納入未硬化組。

1.2.3 收集可能的影響因素：統(tǒng)計(jì)硬化組和未硬化組的相關(guān)資料，包括性別、年齡、BMI、吸煙、飲酒、高血壓、空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triacylglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density cipoprotein-cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(hight density cipoprotein-cholesterol，HDL-C)、血尿酸(uric acid，UA)、超敏C反應(yīng)蛋白(high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP)、高膽固醇血癥、缺血性事件史(冠心病、缺血性腦血管疾病、外周動(dòng)脈疾病等)、糖尿病。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血清miR-181b、miR-27a相對(duì)表達(dá)量比較

血脂異?；颊哐錷iR-181b相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，而miR-27a相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組(P<0.05)。兩組中男性與女性以及年齡≥60歲和<60歲miR-181b、miR-27a相對(duì)表達(dá)量無(wú)差異(表1)。

表1 miR-181b、miR-27a mRNA相對(duì)表達(dá)量比較Table 1 Comparison of relative miRNA expression of

2.2 硬化組與未硬化組發(fā)生CAS可能因素差異比較

血脂異?；颊咧?9例發(fā)生CAS，CAS發(fā)生率為57.84%。硬化組外周血清miR-181b mRNA相對(duì)表達(dá)量低于未硬化組，外周血清miR-27a mRNA相對(duì)表達(dá)量、hs-CRP、LDL-C水平高于未硬化組，高血壓占比大于未硬化組(P<0.05)；兩組年齡、FBG、BMI、TG、TC、HDL-C、UA水平及性別、吸煙、飲酒、高膽固醇血癥、缺血性事件史、糖尿病構(gòu)成比比較無(wú)差異(表2)。

表2 硬化組與未硬化組發(fā)生CAS可能因素差異比較Table 2 Comparison of possible factors of CAS between cirrhosis group and non cirrhosis group

2.3 Logistic多因素回歸分析CAS發(fā)生的影響因素

將可能影響血脂異?；颊甙l(fā)生CAS的影響因素作為自變量(X)，以是否發(fā)生CAS為因變量(Y)，進(jìn)行相關(guān)因素賦值，發(fā)生CAS記為1，未發(fā)生記為0，賦值結(jié)果見(jiàn)表3。Logistic回歸分析顯示，外周血清miR-181b、miR-27a水平、hs-CRP、LDL-C、高血壓均是影響血脂異?；颊甙l(fā)生CAS的獨(dú)立影響因素(P<0.05)(表4)。

表3 Logistic多因素回歸分析賦值Table 3 Assignment of Logistic multiple regression analysis

表4 Logistic多因素回歸分析發(fā)生CAS的獨(dú)立影響因素Table 4 Independent influencing factors of CAS in Logistic multiple factor regression analysis

2.4 外周血清miR-181b、miR-27a相對(duì)表達(dá)量對(duì)血脂異?；颊甙l(fā)生CAS的預(yù)測(cè)價(jià)值分析

以miR-181b相對(duì)表達(dá)量<18.33、miR-27a相對(duì)表達(dá)量>1.54為陽(yáng)性，二者均為陽(yáng)性為聯(lián)合檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)Kappa一致性檢驗(yàn)，血清miR-181b聯(lián)合miR-27a預(yù)測(cè)CAS的效能較高(Kappa=0.801，P<0.05)(表5)。

2.5 外周血清miR-181b、miR-27a相對(duì)表達(dá)量與Crouse積分的相關(guān)性分析

硬化組的Crouse積分為(9.35±1.20)分，血清miR-181b相對(duì)表達(dá)量與Crouse積分呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，外周血清miR-27a 相對(duì)表達(dá)量與Crouse積分呈正相關(guān)(P<0.05)。

3 討論

生化檢測(cè)技術(shù)作為診斷、預(yù)測(cè)疾病的方式，具有操作簡(jiǎn)單、創(chuàng)傷小、可重復(fù)性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，是CAS輔助診斷的首選。隨著基因?qū)W技術(shù)的不斷發(fā)展，miRNA受到關(guān)注，作為參與機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育、疾病發(fā)生的調(diào)控基因，miRNA參與AS的發(fā)生、發(fā)展及斑塊破裂的全過(guò)程[9]。本研究通過(guò)探討血脂異常患者中外周血清miR-181b、miR-27a的表達(dá)差異及其與CAS的關(guān)系，以期尋找可早期預(yù)測(cè)CAS的生物學(xué)標(biāo)志物。

miR-181b能夠調(diào)控血管炎性反應(yīng)，其表達(dá)水平下降能下調(diào)p70S6K表達(dá)增加巨噬細(xì)胞活性，抑制CAS斑塊的形成，因此miR-181b的表達(dá)水平與CAS的發(fā)生密切相關(guān)[10]。miR-27a屬于基因間miRNA，參與調(diào)控糖脂代謝、脂肪細(xì)胞分化、血管生成、炎性因子的表達(dá)等影響CAS發(fā)生的相關(guān)因素[11]。miR-27a可靶向沉默ABCA1的表達(dá)及其介導(dǎo)的膽固醇流出，增加細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積[12]。本研究中血脂異?；颊咧型庵苎錷iR-181b相對(duì)表達(dá)量下降，miR-27a相對(duì)表達(dá)量升高，說(shuō)明外周血清miR-181b、miR-27a的異常表達(dá)與血脂異常的發(fā)生有關(guān)，推斷可通過(guò)檢測(cè)外周血清miR-181b、miR-27a的表達(dá)監(jiān)測(cè)CAS的發(fā)生。

本研究還顯示，硬化組外周血清miR-181b、miR-27a、hs-CRP、LDL-C水平及高血壓占比與未硬化組存在差異，Logistic回歸分析均是發(fā)生CAS的獨(dú)立影響因素，說(shuō)明除hs-CRP、LDL-C、高血壓等常規(guī)影響因素外，miR-181b、miR-27a亦是CAS發(fā)生的影響因素。CAS屬于血管慢性炎性疾病，miR-181b可通過(guò)影響血管內(nèi)皮炎性反應(yīng)參與CAS的發(fā)生，其表達(dá)水平下降可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成[13]。miR-27是具有脂代謝調(diào)節(jié)作用相關(guān)基因，可影響過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ及其下游脂肪酸代謝相關(guān)靶基因和靶蛋白的表達(dá)，影響體脂代謝[14]。此外本研究中ROC顯示外周血清miR-181b、miR-27a預(yù)測(cè)血脂異?；颊甙l(fā)生CAS具有一定的臨床價(jià)值，二者聯(lián)合的一致性較好，且血清miR-181b、miR-27a表達(dá)水平與Crouse積分均有明顯的相關(guān)性，證實(shí)血清miR-181b、miR-27a表達(dá)水平可作為預(yù)測(cè)CAS的生物學(xué)標(biāo)志物。

綜上所述，血清miR-181b、miR-27a在血脂異常患者中表達(dá)異常且是導(dǎo)致CAS的獨(dú)立影響因素，其中miR-181b的表達(dá)與CAS病變程度呈負(fù)相關(guān)，miR-27a則呈正相關(guān)。今后可考慮通過(guò)監(jiān)測(cè)外周血清miR-181b、miR-27a表達(dá)量作為預(yù)測(cè)CAS的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)及病情嚴(yán)重程度判定的生化指標(biāo)，以指導(dǎo)臨床治療。