鄒威鳳，王曉茜，盛 青，祝 濤，周曉婷

(廣州市胸科醫(yī)院 呼吸科,廣東 廣州 510095)

隨著大氣污染的日益嚴(yán)重和慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases,COPDs)(簡稱慢阻肺)患病率的上升，直徑≤2.5 μm的細(xì)顆粒物(fine particulate matter≤2.5 μm in diameter，PM2.5)在慢阻肺發(fā)病中的作用日益受到關(guān)注，但其機(jī)制尚不明了。研究顯示 PM2.5 可致氣道上皮細(xì)胞損傷，隨后誘導(dǎo)一系列炎性因子和生長因子等的分泌導(dǎo)致氣道慢性炎性反應(yīng)持續(xù)存在[1]。炎性反應(yīng)貫穿慢阻肺發(fā)展的整個(gè)過程，是慢阻肺氣流受限的重要機(jī)制[2]。既往研究表明慢阻肺患者誘導(dǎo)痰中無翼型整合位點(diǎn)家族成員5a(Wnt-5a)表達(dá)上調(diào)且與氣道阻塞程度成正相關(guān)[3]。PM2.5 可能通過誘導(dǎo)Wnt-5a的分泌促進(jìn)慢阻肺大鼠氣道炎性反應(yīng),并促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞分泌炎性介質(zhì)[4]。上述研究提示W(wǎng)nt-5a在PM2.5相關(guān)慢阻肺的氣道炎性反應(yīng)中扮演了重要角色。前期研究顯示PM2.5可誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞中Wnt-5a的表達(dá)。研究提示W(wǎng)nt-5a/c-Jun N 端激酶通路的激活參與了慢阻肺炎性反應(yīng)[5]。因此本研究將在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討PM2.5是否通過Wnt-5a/JNK信號(hào)通路調(diào)控氣道上皮細(xì)胞IL-6和TNF-α的分泌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及動(dòng)物：人支氣管上皮細(xì)胞系16HBE (廣州醫(yī)科大學(xué)提供)；18只雌性SD大鼠(體質(zhì)量180～200 g，6～8周齡)飼養(yǎng)于廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心內(nèi)，飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)條件參照之前的研究[6]。

1.1.2 試劑(盒)及PM2.5的方案：DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)；無翼型整合位點(diǎn)家族成員5a (Wingless-related integration site 5a，Wnt-5a)、Wnt-5a siRNA、JNK(c-Jun-N terminal kinase，JNK)、c-Jun、p-JNK和p-c-Jun(Santa Cruz公司)；SP600125(Sigma-Aldrich公司)；IL-6 和TNF-αELISA試劑盒(R&D公司)。直徑≤2.5 μm 的細(xì)顆粒物(fine particulate matter≤2.5 μm in diameter，PM2.5)采集自廣東省廣州市東風(fēng)西路繁忙道路旁，采集的標(biāo)本凍存于-80 ℃?zhèn)溆?，?biāo)本的詳細(xì)信息和分析方法參照之前的研究[6]。

1.2 方法

1.2.1 分組及處理：本研究分大鼠和16HBE兩部分。將大鼠分為清潔空氣對(duì)照組，吸入機(jī)動(dòng)車尾氣組(機(jī)動(dòng)車尾氣濃度1.5 mg/m3，2 h/d，1個(gè)月)。在機(jī)動(dòng)車尾氣暴露室，PM2.5濃度是(1.46±0.03)mg/m3。最后通過腹腔內(nèi)注射戊巴比妥(100 mg/kg)將大鼠處死，雙肺用4%多聚甲醛(pH 7.40)固定24 h，將肺組織包埋于石蠟中，切成4 μm厚的切片；人支氣管上皮細(xì)胞系16HBE按2×10-5個(gè)細(xì)胞/瓶將細(xì)胞接種于6孔板中，使細(xì)胞增殖達(dá)到60%～70%匯合。將細(xì)胞分為對(duì)照組、PM2.5(20 μg/mL)組、陰性對(duì)照siRNA+PM2.5組、Wnt-5a siRNA+PM2.5組、Wnt-5a siRNA+對(duì)照組、JNK抑制劑SP600125+PM2.5組、SP600125+對(duì)照組(每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔)。細(xì)胞干預(yù)前24 h將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，當(dāng)細(xì)胞匯合達(dá)60%時(shí)，分別預(yù)先加入Wnt-5a siRNA、陰性siRNA培養(yǎng)24 h或SP600125培養(yǎng)1 h，再繼續(xù)加入PM2.5刺激培養(yǎng)24 h。

1.2.2 免疫組化檢測(cè)肺組織中p-JNK和p-c-Jun蛋白的表達(dá)：將肺組織切片脫蠟水化,并分別與p-JNK抗體(1∶100)和p-c-Jun抗體(1∶100)在室溫下孵育1 h，洗滌后，加羊抗鼠HRP二抗，室溫下孵育1 h，DAB 法顯色。在共聚焦顯微鏡(×200)下進(jìn)行評(píng)估，使用半定量評(píng)分系統(tǒng)對(duì)p-JNK和p-c-Jun陽性細(xì)胞的吸光度進(jìn)行定量。

1.2.3 Western blot檢測(cè)16HBE細(xì)胞中Wnt-5a、p-JNK、p-c-Jun蛋白的表達(dá)：提取細(xì)胞蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取 50 μg蛋白上樣，電泳結(jié)束后將目的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(200 mA，2 h)，加Wnt-5a抗體(1∶1 000)、p-JNK抗體(1∶1 000)、p-c-Jun抗體(1∶1 000)、GAPDH抗體(1∶5 000)室溫下孵育1 h。DAB 法顯色，電泳凝膠成像分析儀采集結(jié)果。用Image J圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行吸光度值分析。結(jié)果以目的蛋白的吸光度值除以內(nèi)參GAPDH的吸光度值表示。

1.2.4 ELISA檢測(cè)16HBE中IL-6和TNF-α的分泌:按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 機(jī)動(dòng)車尾氣(motor vehicle exhaust,MVE)暴露對(duì)大鼠肺組織p-JNK和p-c-Jun蛋白表達(dá)水平的影響

MVE組大鼠支氣管上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞p-JNK和p-c-Jun表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(圖1)。

A.representative expression of p-JNK and p-c-Jun(×200)；B.statistical analysis of p-JNK and p-c-Jun A value；*P<0.05 compared with control group圖1 免疫組化檢測(cè)大鼠肺組織p-JNK和p-c-Jun蛋白的表達(dá)Fig 1 Immunohistochemistry examined the expression of p-JNK and p-c-Jun in the lungs of

2.2 不同處理組16HBE細(xì)胞中Wnt-5a蛋白表達(dá)的比較

與PM2.5組相比，Wnt-5a siRNA+PM2.5組Wnt-5a的表達(dá)顯著減少(P<0.05)；與對(duì)照組相比，Wnt-5a siRNA+對(duì)照組Wnt-5a的表達(dá)顯著減少(P<0.05)(圖2)。

A.effects of Wnt-5a siRNA on expression of Wnt-5a；B.statistical analysis of Wnt-5a protein expression level；#P<0.05 compared with control group；*P<0.05 compared with PM2.5 group圖2 Western blot檢測(cè)16HBE細(xì)胞中的Wnt-5a蛋白表達(dá)水平Fig 2 Western blot examined the expression of

2.3 不同處理組16HBE中p-JNK和JNK蛋白表達(dá)的比較

與對(duì)照組相比，PM2.5組p-JNK蛋白的表達(dá)明顯增加(P<0.05)；與PM2.5組相比，Wnt-5a siRNA+PM2.5組p-JNK蛋白的表達(dá)明顯減少(P<0.05)(圖3)。

A.effects of Wnt-5a siRNA on expression of p-JNK and JNK；B.statistical analysis of p-JNK/JNK ratio；#P<0.05 compared with control group；*P<0.05 compared with PM2.5 group圖3 Western blot檢測(cè)16HBE中p-JNK和JNK的蛋白表達(dá)水平Fig 3 Western blot examined the expression of p-JNK and JNK in

2.4 不同處理組16HBE中p-c-Jun和c-Jun蛋白表達(dá)的比較

與對(duì)照組相比，PM2.5組JNK的下游蛋白p-c-Jun的表達(dá)明顯增加(P<0.05)；與PM2.5組相比，Wnt-5a siRNA+PM2.5組p-c-Jun蛋白的表達(dá)明顯減少(P<0.05)(圖4A，B)，SP600125+PM2.5組p-c-Jun蛋白的表達(dá)明顯減少(P<0.05)(圖4C，D)。

A.effects of Wnt-5a siRNA on expression of p-c-Jun and c-Jun；B.statistical analysis of p-c-Jun/c-Jun ratio；C.effects of SP600125 on expression of p-c-Jun and c-Jun；D.statistical analysis of p-c-Jun/c-Jun ratio；#P<0.05 compared with control group；*P<0.05 compared with PM2.5 group圖4 Western blot檢測(cè)16HBE中的p-c-Jun和c-Jun蛋白表達(dá)水平Fig 4 Western blot examined the expression of p-c-Jun and c-Jun in

2.5 不同處理組16HBE中分泌炎性因子IL-6和TNF-α的比較

與對(duì)照組相比，PM2.5組IL-6和TNF-α的分泌明顯增加(P<0.05)；與PM2.5組相比，Wnt-5a siRNA+PM2.5組IL-6和TNF-α的分泌明顯減少 (P<0.05)(圖5A)，SP600125+PM2.5組IL-6和TNF-α的分泌明顯減少(P<0.05)(圖5B)。

A.effects of Wnt-5a siRNA on the secretion of IL-6 and TNF-α；B.effects of SP600125 on the secretion of IL-6 and TNF-α；#P<0.05 compared with control group；*P<0.05 compared with PM2.5 group圖5 ELISA檢測(cè)16HBE中IL-6和TNF-α的分泌Fig 5 ELISA examined the secretion of IL-6 and TNF-α in

3 討論

近年來大量流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)空氣污染中的 PM2.5可增加慢阻肺的發(fā)病率、急性加重風(fēng)險(xiǎn)、肺功能下降及病死率[7]。PM2.5 可避開上呼吸道的保護(hù)作用直接進(jìn)入下呼吸道，直接或間接(代謝產(chǎn)物、后續(xù)急慢性炎性反應(yīng))損傷肺組織，對(duì)人體的危害最大。氣道上皮細(xì)胞作為呼吸道對(duì)抗有害氣體和顆粒的第一道解剖屏障，在慢阻肺的發(fā)生發(fā)展過程中有著關(guān)鍵作用[8]，可以通過釋放一系列炎性因子如TNF-α和IL-6等參與慢阻肺氣道結(jié)構(gòu)重塑，最終導(dǎo)致不可逆氣流受限。本研究發(fā)現(xiàn)大鼠暴露于機(jī)動(dòng)車尾氣可誘導(dǎo)肺組織p-JNK和p-c-Jun上調(diào)。PM2.5誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞中Wnt-5a、p-JNK和p-c-Jun表達(dá)上調(diào)，并誘導(dǎo)IL-6和TNF-α的分泌，提示W(wǎng)nt-5a/JNK信號(hào)通路可能參與PM2.5相關(guān)慢阻肺氣道炎性反應(yīng)的過程。

Wnt-5a屬于Wnts蛋白家族成員之一，是一種富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域的分泌性糖蛋白，其表達(dá)水平與某些肺部疾病直接或間接相關(guān)。研究表明慢阻肺患者誘導(dǎo)痰中Wnt-5a表達(dá)上調(diào)且與氣道阻塞程度成正相關(guān)[3]。在慢阻肺大鼠模型中，CSE和炎性因子協(xié)同作用上調(diào)Wnt-5a的表達(dá)，抑制 Wnt-5a的表達(dá)能改善肺功能[9]。PM2.5誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞中Wnt-5a的表達(dá)[10]。上述研究提示W(wǎng)nt-5a的表達(dá)調(diào)控及其信號(hào)傳導(dǎo)與PM2.5相關(guān)的慢阻肺氣道炎性應(yīng)答密切相關(guān)。

Wnt-5a可作為重要的炎性介質(zhì)通過非經(jīng)典Wnt通路誘導(dǎo)JNK的活化。JNK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞的增殖、分化及凋亡的過程中發(fā)揮重要的作用，與細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)及炎性反應(yīng)有明顯的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)PM2.5暴露的動(dòng)物模型中JNK的表達(dá)上調(diào)[11]。本研究顯示W(wǎng)nt-5a siRNA抑制了PM2.5誘導(dǎo)16HBE中JNK和c-Jun磷酸化、p-JNK/JNK和p-c-Jun/c-Jun比值，也抑制了IL-6和TNF-α分泌。各種刺激因子可誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞中p-JNK的表達(dá)[12]。JNK抑制劑SP600125抑制PM2.5促進(jìn)人成纖維細(xì)胞中IL-6的產(chǎn)生[13]。本研究結(jié)果進(jìn)一步提示SP600125降低了PM2.5誘導(dǎo)16HBE中p-c-Jun/c-Jun比值及IL-6和TNF-α的分泌。這說明Wnt-5a/JNK信號(hào)通路在PM2.5誘導(dǎo)16HBE分泌的IL-6和TNF-α中起重要作用。

綜上所述，Wnt-5a可能通過促進(jìn)p-JNK和p-c-Jun的表達(dá)參與了PM2.5誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞系IL-6和TNF-α炎性因子的分泌，從而促進(jìn)了PM2.5相關(guān)慢阻肺患者的氣道炎性反應(yīng)。該研究為有針對(duì)性的治療慢阻肺尋找有效的藥物新靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。