鄒雪蓮，胡 雯，雷子賢，王紅娟，徐 晨，哈麗娜·海若拉，康曉靜*

(1.安徽醫(yī)科大學 新疆臨床學院，新疆 烏魯木齊830001；2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院 皮膚性病科，新疆 烏魯木齊830001；3.新疆維吾爾自治區(qū)科技廳 新疆皮膚病研究重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830001)

白癜風是一種常見的獲得性色素脫失性疾病，氧化應(yīng)激導致功能性黑素細胞破壞是其發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。除黑素細胞外，角質(zhì)形成細胞在白癜風的發(fā)生發(fā)展中同樣發(fā)揮了重要作用[2-3]。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)靶向細胞抗氧化損傷的相關(guān)基因，研究表明其參與白癜風發(fā)病的黑素細胞Nrf2活化缺陷[4]。驅(qū)蟲斑鳩菊(Vernoniaanthelmintica(L.)Willd.)是新疆治療白癜風的傳統(tǒng)特色藥物。上世紀70年代，驅(qū)蟲斑鳩菊針劑已用于治療白癜風，臨床療效顯著[5]。其化學成分復(fù)雜，目前普遍認為黃酮類化合物是發(fā)揮治療作用的主要成分。山奈酚(Kaempferol，KP)作為最常見的天然黃酮類化合物，廣泛存在于綠葉蔬菜及韭菜和龍蒿等草本植物中，具有抗氧化、抗癌、抗感染、抗菌等功能[6]。本研究擬探索KP對HaCaT細胞內(nèi)Nrf2及其下游抗氧化基因的表達影響，明確驅(qū)蟲斑鳩菊的抗氧化作用及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

驅(qū)蟲斑鳩菊(新疆烏魯木齊市埃力克維吾爾醫(yī)大藥房)由新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所鑒定為菊科植物驅(qū)蟲斑鳩菊Vernoniaanthelmintica(L.)Willd.的種子。各黃酮類化合物標準品(Sigma-Aldrich和Steraloids公司)；人永生化角質(zhì)形成細胞系(human immortalized keratinocytes，HaCaT)(中國科學院昆明細胞庫)；山奈酚(kaempferol，KP，分子式：C15H10O6)、2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽[2,2-azobis (2-methylpropionamidine)dihydrochloride，AAPH，分子式：C8H18N6·2(HCl)](北京索萊寶科技有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司)；RT-qPCR試劑盒(Qiagen公司)；Nrf2抗體(Proteintech公司)。

1.2 方法

1.2.1 驅(qū)蟲斑鳩菊種子總黃酮含量測定及黃酮類物質(zhì)定量：用60%乙醇溶液對適量混勻的樣品進行兩次超聲提取，濾液并于容量瓶中，即為供試品。取2.0 mL供試品于比色管中，用60%乙醇補充至5.0 mL，依次加入50 g/L亞硝酸鈉、100 g/L硝酸鋁及200 g/L氫氧化鈉后，用60%乙醇定容，搖勻，放置15 min。用1 cm比色皿以相應(yīng)的不添加100 g/L硝酸鋁的試樣液作為空白進行校正，在波長510 nm處測定吸光度值。根據(jù)公式計算樣品中總黃酮含量。取適量供試品于離心管中，離心后取上清，液質(zhì)聯(lián)用分析用Waters ACQUITY UPLC I-Class系統(tǒng)，多反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)質(zhì)譜分析用Sciex 5500 QTRAP質(zhì)譜儀，黃酮類物質(zhì)定量用Analyst軟件。

1.2.2 細胞的分組及處理：將HaCaT細胞分為對照組，AAPH模型組，低、中、高劑量KP干預(yù)組。3～5代細胞用于實驗，用含1%雙抗、10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基對HaCaT細胞進行常規(guī)培養(yǎng)，細胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，每2天更換1次培養(yǎng)液，光學顯微鏡下持續(xù)觀察細胞，待細胞匯合度為80%～90%且狀態(tài)良好時，用胰蛋白酶消化傳代，進行后續(xù)實驗。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞增殖：按照每孔100 μL細胞懸液接種于96孔板中，每孔內(nèi)加1×103個細胞，設(shè)置不同濃度梯度的AAPH(以一定質(zhì)量粉末直接溶于完全培養(yǎng)基中配制而成)或山奈酚，并設(shè)立空白對照，每組5個復(fù)孔，置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)一定時間后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，在酶標儀450 nm處測定吸光度值，計算細胞增殖率。實驗至少重復(fù)3次。

1.2.4 不同濃度山奈酚對HaCaT細胞形態(tài)的影響：調(diào)整細胞為5×105個/mL，以每孔2 mL接種于6孔板中，經(jīng)不同濃度KP(10、20、30 μmol/L)及AAPH處理后，用倒置相差顯微鏡觀察各組的HaCaT細胞形態(tài)學變化。

1.2.5 RT-qPCR檢測細胞中Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC和GCLM mRNA水平：常規(guī)提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行RT-qPCR檢測。引物設(shè)計及合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成，Nrf2上游引物：5′-TCCAAGTCCAGAAGCCAA ACTGAC-3′，下游引物：5′-GGAGAGGATGCTGCTG AAGGAATC-3′；血紅素加氧酶-1(heme oxygenase 1，HO-1)上游引物：5′-TGCCAGTGCCACCAAGTTCA AG-3′，下游引物：5′-TGTTGAGCAGGAACGCAGTCT TG-3′；還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸醌氧化還原酶1[NAD(P)H quinone dehydrogenase 1，NQO1]上游引物：5′-GTCGGCAGAAGAGCACTGATCG-3′，下游引物：5′-ACTCCACCACCTCCCATCCTTTC-3′；谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基(glutamate-cysteine ligase catalytic subunit，GCLC)上游引物：5′-CT TTCTCCCCAGACAGGACC-3′，下游引物：5′-CAAGG ACGTTCTCAAGTGGG-3′；谷氨酸-半胱氨酸連接酶調(diào)節(jié)亞基(glutamate-cysteine ligase modifier subunit，GCLM)上游引物：5′-TGCTGTGTGATGCCACCAGA TTTG-3′，下游引物：5′-GTGCGCTTGAATGTCAGG AATGC-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-GGAGCGAGA TCCCTCCAAAAT-3′，下游引物：5′-GGCTGTTGTC ATACTTCTCATGG-3′。

1.2.6 Western blot檢測Nrf2蛋白表達：收集各組細胞，以RIPA裂解液裂解并提取細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白含量后，95 ℃蛋白變性10 min，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入Nrf2一抗(1∶2 000)4 ℃孵育過夜，次日二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h，增強化學發(fā)光法(ECL)顯色并拍照。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 驅(qū)蟲斑鳩菊種子代謝物標準品XIC圖

黃酮類物質(zhì)標準品的XIC圖顯示各代謝物的色譜分離較好，峰形尖銳對稱，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，能夠?qū)Ω鞔x物進行質(zhì)譜定量。

2.2 驅(qū)蟲斑鳩菊類黃酮物質(zhì)定量結(jié)果

通過乙醇萃取法測定驅(qū)蟲斑鳩菊種子總黃酮類物質(zhì)含量為0.97 g/100 g。定量分析共獲得36種合類黃酮化合物，其中異黃酮和黃酮苷類各9種，黃烷類7種，黃酮類5種，O-甲基化類黃酮查爾酮和羥基肉桂酸各2種，二氫查爾酮類和黃烷酮類各1種。以黃烷類化物圣草酚含量最高，為12 651 ng/100 g。KP含量為63 ng/100 g。保留時間最短的為黃烷類化合物(-)-表沒食子兒茶素，保留時間為2.76 min；最長的為異黃酮化合物葛根素，保留時間為10.81 min。KP保留時間為9.07 min。驅(qū)蟲斑鳩菊種子主要黃酮類物質(zhì)定量結(jié)果見表1。

表1 驅(qū)蟲斑鳩菊種子中主要黃酮類物質(zhì)含量Table 1 Contents of main flavonoids in the seeds of Vernonia anthelmintica (L.)Willd.

2.3 CCK-8法檢測AAPH和KP對HaCaT細胞增殖的影響

AAPH呈劑量依賴性抑制細胞增殖(P<0.001)，選擇25 mmol/L作為本實驗的造模濃度，此時細胞存活率為(62.33±4.98)%(圖1A)。KP濃度為0～40 μmol/L時，未見明顯細胞毒性。安全劑量的KP可減輕AAPH導致的細胞損傷，隨著山奈酚濃度的升高，HaCaT細胞存活率逐漸恢復(fù)(P<0.05)(圖1C)。故后續(xù)實驗選擇10、20、30 μmol/L為KP低、中、高劑量組(細胞存活率分別為77.86%±0.79%、84.01%±2.80%和89.42%±3.01%)(圖1)。

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with model group圖1 CCK-8檢測AAPH和KP對HaCaT細胞增殖的影響Fig 1 CCK-8 detection of the effects of AAPH and KP on the proliferation of HaCaT cells

2.4 不同濃度KP對HaCaT細胞形態(tài)學的影響

對照組細胞形態(tài)近似梭形或多角形，邊緣清晰，樹突多。模型組細胞形態(tài)略偏橢圓形或圓形，邊緣模糊，貼壁細胞數(shù)量減少。不同濃度的KP干預(yù)HaCaT細胞后，細胞形態(tài)在一定程度上得到恢復(fù)(圖2)。

A-E.control group;model group;low-,medium-,high-dose KP intervention groups圖2 不同濃度KP對HaCaT細胞的形態(tài)學影響Fig 2 Effects of different concentrations of KP on morphology of HaCaT cells (×100)

2.5 KP對HaCaT細胞內(nèi)Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC及GCLM mRNA表達的影響

與對照組相比，25 mmol/L AAPH可增加細胞內(nèi)Nrf2、HO-1、GCLC和GCLM mRNA的表達水平；與模型組相比，低劑量KP可增加HaCaT細胞內(nèi)Nrf2、HO-1和GCLC mRNA表達水平，高劑量KP僅增加細胞內(nèi)Nrf2 mRNA表達水平。其中低劑量KP對HO-1的影響最為顯著，表達增量為對照組的48倍、模型組的4倍(圖3)。

*P<0.05 compared with control；#P<0.05 compared with model圖3 KP對HaCaT細胞Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC及GCLM mRNA表達的影響Fig 3 Effects of KP on the expression of Nrf2,HO-1,NQO1,GCLC and GCLM mRNA in HaCaT cells

2.6 KP對HaCaT細胞內(nèi)Nrf2蛋白表達的影響

與對照組相比，模型組HaCaT細胞內(nèi)Nrf2蛋白表達增加(P<0.05)。與模型組相比，不同劑量KP可呈濃度依賴性增加細胞內(nèi)Nrf2蛋白表達(P<0.05)(圖4)。

*P<0.05 compared with control；#P<0.05 compared with model圖4 KP對HaCaT細胞Nrf2蛋白表達的影響Fig 4 Effect of KP on the expression of Nrf2 protein in HaCaT cells

3 討論

驅(qū)蟲斑鳩菊為菊科Compositae斑鳩菊屬一年生草本植物，目前對這一傳統(tǒng)藥物的研究多局限在總黃酮提取層面，黃酮類單體的研究相對較少。本實驗測定驅(qū)蟲斑鳩菊種子總黃酮類物質(zhì)含量為0.97 g/100 g，共獲得36種黃酮類化合物，是目前國內(nèi)對驅(qū)蟲斑鳩菊種子中黃酮類物質(zhì)種類鑒定最多的一次報道。KP是驅(qū)蟲斑鳩菊黃酮類化合物中生物利用度最高的一種單體，可顯著增加黑素合成基因的表達并提高酪氨酸酶活性[7]，提示KP是驅(qū)蟲斑鳩菊發(fā)揮治療作用的一種有效成分。本實驗明確KP在驅(qū)蟲斑鳩菊種子中的定量，為62.96 ng/100 g。AAPH是可靠的氧化應(yīng)激造模藥物，其與HaCaT細胞共同構(gòu)建的體外氧化應(yīng)激模型更加經(jīng)濟有效且易于重現(xiàn)，適用于多種氧化應(yīng)激相關(guān)皮膚疾病的病理研究[8]。本實驗以AAPH刺激HaCaT細胞模擬白癜風體外氧化應(yīng)激，用不同濃度KP對細胞進行預(yù)處理，結(jié)果表明KP可以保護HaCaT細胞對抗AAPH誘導的細胞損傷。

Nrf2是保護細胞免受氧化損傷的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[9]。氧化應(yīng)激時，Nrf2與伴侶蛋白解偶聯(lián)并快速轉(zhuǎn)移入核，與細胞內(nèi)的抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，啟動下游抗氧化基因的表達，提高細胞對氧化損傷的抵抗性。這些基因主要包括HO-1、NQO1、GCLC與GCLM。其中HO-1的上調(diào)可極大提高細胞對氧化損傷的保護作用[10-11]。健康人黑素細胞的體外氧化應(yīng)激模型中Nrf2及下游抗氧化基因的mRNA和蛋白表達增加[12-13]。本實驗在HaCaT細胞的體外氧化應(yīng)激模型中得到了同樣的結(jié)果。KP在體外具有極強的抗氧化活性，可直接清除活性氧簇，激活Nrf2/HO-1通路[14]，提示KP是一種Nrf2激活劑。與之一致，本研究發(fā)現(xiàn)KP可增加HaCaT細胞內(nèi)Nrf2 mRNA和蛋白表達，且呈濃度依賴性；同時本研究發(fā)現(xiàn)低劑量KP可顯著增加HO-1 mRNA表達，提示KP可能通過調(diào)控Nrf2/HO-1抗氧化信號通路發(fā)揮作用，尚需進一步實驗驗證。

綜上所述，本研究表明驅(qū)蟲斑鳩菊成分KP能上調(diào)Nrf2的表達，從而減輕AAPH誘導的HaCaT細胞氧化應(yīng)激損傷。同時，本研究表明驅(qū)蟲斑鳩菊在抗氧化應(yīng)激方面也具有一定的應(yīng)用前景，有希望成為氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的治療用藥。