劉曉蕾，王 強，張曉璐，邵 國*，姜樹原,3*

(包頭醫(yī)學(xué)院1.內(nèi)蒙古自治區(qū)低氧轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點實驗室；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院；3.藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040)

N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的興奮突觸傳遞、突觸可塑性和興奮性毒性中起關(guān)鍵作用。NR是由2個NR1亞基和2個NR2亞基構(gòu)成的異聚體。NR2A以及NR2B亞基，主要在成人大腦皮層和海馬中表達[1-2]。前腦中過表達NR2B的小鼠，其在各種學(xué)習(xí)記憶行為中表現(xiàn)出卓越的學(xué)習(xí)和記憶能力[3]。然而，通過反義RNA敲低NR2B表達，可消除NMDA依賴性的長時程增強(long-term potentia-tion，LTP)，造成空間學(xué)習(xí)記憶能力損傷。

突觸可塑性和行為與p-Y1472 NR2B密不可分。研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠島葉皮層突觸后致密物(postsynaptic density，PSD)中，p-Y1472 NR2B水平升高，對大鼠的學(xué)習(xí)能力有一定的影響。5-Aza-CdR可提高小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，降低PP-1γ活性[4]。抑制PP-1活性可降低CDK5的活性[5]。抑制CDK5的活性可使突觸中Src激酶活性和p-Y1472 NR2B水平升高[6]。因此，推斷5-Aza-CdR可能通過PP-1/CDK5通路改變p-Y1472 NR2B水平影響學(xué)習(xí)記憶功能。

在表觀遺傳學(xué)研究中，由于DNA甲基化對正常細胞有重要的影響，所以去甲基化試劑5-雜氮脫氧胞嘧啶核苷(5-Aza-2′-deoxycytidine,5-Aza-CdR)對細胞周期、分化、死亡及改變動物行為也有著舉足輕重的作用[4,7]。前期研究發(fā)現(xiàn)，5-Aza-CdR能使小鼠在水迷宮中的行為有所改變，同時NR2B及其位點的磷酸化在小鼠行為中也扮演著重要角色，因此，本文旨在探討5-Aza-CdR對小鼠海馬NR2B及其磷酸化的影響，以及其在跳臺實驗中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級6～8周齡ICR雄性小鼠(斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司[SCXK (京)2016-0002])，體質(zhì)量18～22 g,60只。本研究經(jīng)包頭醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會批準[包醫(yī)倫審 2018第(012)號]。在實驗過程中，嚴格按實驗動物使用的3R原則給與人道的關(guān)懷。

1.1.2 主要試劑：5-Aza-CdR(Sigma-Aldrich 公司)；TRIzol(Invitrogen公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×SYBR Green qPCR Master Mix(TaKaRa公司)；RIPA細胞裂解液、ECL發(fā)光液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；蛋白酶抑制劑HaltTMProtease and Phosphatase Inhibitor Single-Use Cocktail (×100)(Thermo Fisher公司)；BCA蛋白檢測試劑盒(美國Pierce公司)；兔抗NR2B抗體、兔抗NR2B多克隆抗體(Cell Signaling Technology公司)；兔抗p-Y1472 NR2B抗體(Phosphosolutions公司)；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的驢抗兔二抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；ADP-GloTM+ CDK5/p35 Kinase Enzyme System試劑盒(Promega公司)；Texas Red標(biāo)記的山羊抗兔二抗(Jackson Laboratory公司)；含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)的封片劑(Vector公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物的分組及處理：將小鼠隨機分為對照組(control)和5-Aza-CdR處理組(5-Aza-CdR)，右側(cè)腦室內(nèi)注射5 μL 10 μmol/L的5-Aza-CdR。使用顯微注射泵以1 μL/min的速率注射5 min，留針1 min以防止回流。緩慢退針，縫合傷口。側(cè)腦室注射方法見參考文獻[5]。

1.2.2 跳臺實驗檢測：跳臺實驗是海馬依賴性認知實驗，可以評估短期記憶和長期記憶[8]，實驗動物為避免電擊而選擇跳臺。通過記錄小鼠被動逃避延遲時間，以及出現(xiàn)差錯的次數(shù)來完成[9]。這個實驗分為兩個部分：訓(xùn)練和測驗。跳臺實驗使用的儀器是SDT-8系統(tǒng)。訓(xùn)練和測驗方法見參考文獻[9]。

1.2.3 Real-time PCR檢測小鼠海馬組織NR2B mRNA：每組取6只小鼠，均斷頭取腦，剝離海馬組織，Trizol法提取小鼠海馬組織RNA并測定其濃度和純度。取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA并擴增,NR2B 上游引物：5′-AACGTTCACGTAGCTCCAG-3′，下游引物：5′-CTCGTCCGATATGGCTCCTTCA-3′；β-actin上游引物：5′-AGCTGATGGTCTGAGACA-3′，下游引物：5′-GCTCATCGATCGCATCAA-3′。使用20 μL反應(yīng)體系。反應(yīng)程序：50 ℃×2 min,95 ℃×3 min,95 ℃ 15 s,58 ℃ 30 s,73 ℃ 30 s，40個循環(huán)，72 ℃ 2 min。根據(jù)數(shù)據(jù)結(jié)果，利用2-ΔΔCt計算mRNA相對表達量。

1.2.4 Western blot 檢測小鼠海馬組織中NR2B和p-Y1472 NR2B蛋白：每組取6只小鼠，均斷頭取腦，剝離海馬組織，加入RIPA裂解液(1 mL/mg)裂解小鼠海馬組織，同時加入蛋白酶抑制劑，冰上超聲裂解，提取海馬組織中的蛋白，BCA法測定蛋白濃度，進行 SDS-PAGE時，蛋白上樣量為20 μg，后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫用5%的脫脂奶粉封閉1 h后，加入一抗(1∶500)，4 ℃過夜，1×TBST洗膜3次，每次8 min，加入HRP標(biāo)記的驢抗兔二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h，1×TBST洗3次，每次8 min，ECL化學(xué)發(fā)光，檢測。

1.2.5 CDK5激酶活性檢測：冰上用玻璃勻漿器將海馬組織制備成勻漿，離心取上清，使用ADP-GloTM+CDK5/p35 Kinase Enzyme System試劑盒檢測其CDK5活性。

1.2.6 免疫熒光檢測NR2B和p-Y1472 NR2B的表達：用0.01 mol/L的PBS沖洗腦組織，然后用含4%多聚甲醛的磷酸緩沖液進行灌注固定，取其腦組織置于4%多聚甲醛，4 ℃下固定 6～8 h，PBS清洗2次。然后，放于30%蔗糖溶液中脫水72 h，OCT進行包埋。使用低溫冷凍恒溫切片機切冠狀切片(厚度20 μm)。切片經(jīng)0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min。用10%山羊血清室溫封閉1 h。加入兔抗NR2B多克隆抗體(1∶300)，4 ℃孵育過夜。用PBS清洗3次，每次10 min，加入Texas Red標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶1 000)室溫避光孵育4 h。PBS清洗3次，每次10 min。用含有DAPI的封片劑封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 5-Aza-CdR對跳臺實驗小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

5-Aza-CdR組較對照組跳臺潛伏期增加，錯誤次數(shù)減少(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05 compared with control group圖1 5-Aza-CdR對跳臺實驗小鼠的影響Fig 1 Effects of 5-Aza-CdR on the step-down test

2.2 5-Aza-CdR對小鼠海馬組織中NR2B和p-Y1472 NR2B表達的影響

5-Aza-CdR組小鼠海馬組織中NR2B的mRNA水平為5.98×10-5±0.27(n=6)與對照組5.62×10-5±0.28 (n=6)相近。5-Aza-CdR組p-Y1472 NR2B的表達水平顯著增強(P<0.05)，NR2B蛋白表達水平與mRNA都沒有明顯變化(圖2)。

A.Western blot;B.semi-quantitative analysis of protein expression;*P<0.05 compared with the control group圖2 5-Aza-CdR對小鼠海馬組織中NR2B和p-Y1472 NR2B表達的影響Fig 2 Effects of 5-Aza-CdR on the expression of NR2B,and p-Y1472

2.3 5-Aza-CdR對小鼠海馬CA1、CA3區(qū)NR2B和p-Y1472 NR2B表達的影響

對照組和5-Aza-CdR組海馬CA1和CA3區(qū)NR2B的熒光強度沒有差異。然而，在5-Aza-CdR組的CA1區(qū)p-Y1472 NR2B表達明顯高于對照組CA1(P<0.05)(圖3)。

A.NR2B in the control group(A1:CA1;A2:CA3);B.NR2B in the 5-Aza group(B1:CA1;B2:CA3);C.NR2B fluorescence intensity;D.p-Y1472 NR2B in the control group(D1:CA1;D2:CA3);E.p-Y1472 NR2B in the 5-Aza group(E1:CA1;E2:CA3);F.p-Y1472 fluorescence intensity;*P<0.05 compared with CA1 and CA3圖3 5-Aza-CdR對小鼠海馬CA1、CA3區(qū)NR2B和p-Y1472 NR2B表達的影響Fig 3 Confocal analysis the immunofluorescence staining of NR2B and p-Y1472 NR2B in the CA1 and CA3 region of the hippocampus in mice that were treated with 5-Aza or

2.4 5-Aza-CdR對小鼠海馬組織中CDK5活性的影響

5-Aza-CdR組中CDK5的活性為0.22±0.04顯著低于對照組的0.27±0.05(P<0.05)。

3 討論

DNA甲基化參與了學(xué)習(xí)和記憶能力的形成[10]，研究發(fā)現(xiàn)，側(cè)腦室注射5-Aza-CdR可以改善小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力(水迷宮實驗)，并降低PP-1γ的表達[4]，PP-1在5-Aza-CdR誘導(dǎo)學(xué)習(xí)和記憶的改變中起到了至關(guān)重要的作用。

PP1通過突觸信號在學(xué)習(xí)和記憶中發(fā)揮重要作用，但PP1如何調(diào)節(jié)突觸可塑性仍然未知[11]。PP1抑制劑可以改變小鼠在跳臺實驗中的行為。本研究發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR可以提高小鼠在跳臺實驗中的學(xué)習(xí)和記憶能力，這種能力的改變可能是通過PP-1γ的表達降低來調(diào)控的。CDK5是一種脯氨酸介導(dǎo)的絲/蘇氨酸激酶，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有很高的活性，PP1可以調(diào)節(jié)CDK5的活性[5]。CDK5已被證明通過調(diào)節(jié)谷氨酸受體的降解來影響學(xué)習(xí)和記憶及突觸可塑性。成人大腦中CDK5的缺失提高了海馬的行為學(xué)習(xí)和記憶能力，并增強了突觸可塑性[12]。本研究中推測5-Aza-CdR通過PP-1γ表達降低而使CDK5活性降低，進而提高了跳臺實驗中動物學(xué)習(xí)和記憶能力。

研究表明CDK5活性的降低導(dǎo)致p-Y1472 NR2B水平的增加。抑制CDK5增加了Src激酶與PSD-95的結(jié)合以及Src激酶對p-Y1472 NR2B的磷酸化作用。NR2B和p-Y1472 NR2B在學(xué)習(xí)和記憶功能中起著關(guān)鍵的作用[13]。本實驗結(jié)果顯示，5-Aza-CdR可以影響CA1區(qū)NR2B的磷酸化水平，并不會影響NR2B的表達。眾所周知，DNA甲基化在調(diào)節(jié)長時程可塑性和記憶中具有重要作用[14]。5-Aza-CdR可通過甲基化和非甲基化調(diào)控基因的表達[15-16]。因此，5-Aza-CdR對細胞或組織的影響是一個復(fù)雜的機制。

總之，5-Aza-CdR可影響小鼠在跳臺中的行為學(xué)，而海馬CA1區(qū)p-Y1472 NR2B的水平變化影響著行為學(xué)的變化。因此5-Aza-CdR如何影響腦中p-Y1472 NR2B變化的分子機制還需進一步深入研究。