陳 澤，胡梓騏，蔣麗杰，李景武，陳 靜，陳 敏，張 昊，張二帥，孫 紅

0 引 言

粘連松解術(shù)是目前臨床上常用解除腹腔粘連的方法[1-2]，但由于術(shù)中又會(huì)造成新的創(chuàng)傷，因而可能導(dǎo)致粘連松解的部位發(fā)生再次粘連[3]?，F(xiàn)有防粘連材料的相關(guān)研究主要針對(duì)于普通手術(shù)創(chuàng)傷所造成的粘連[4]，而針對(duì)粘連松解術(shù)后再粘連預(yù)防的研究相關(guān)報(bào)道較少。

粘連松解手術(shù)對(duì)粘連組織所造成的創(chuàng)傷較常規(guī)外科手術(shù)創(chuàng)傷所導(dǎo)致的粘連更為嚴(yán)重，且再粘連的形成機(jī)制也更加復(fù)雜[5-8]。Yeo等[9]通過將帶有醛基和氨基的透明質(zhì)酸交聯(lián)后得到的原位透明質(zhì)酸水凝膠，在兔的腹壁-盲腸缺損模型中顯示出了良好的防粘連效果，但僅有單純物理隔離作用的透明質(zhì)酸水凝膠并不能有效地的預(yù)防粘連松解術(shù)后再粘連的發(fā)生。本研究前期利用綠色酶解反應(yīng)制得了具有反向“低溫溶膠，體溫凝膠”溫敏特性的改性木葡聚糖(modified xyloglucan, mXG)溫敏水凝膠[10-11]。mXG凝膠在用于預(yù)防腹腔粘連及粘連松解術(shù)后二次粘連的預(yù)防時(shí)發(fā)現(xiàn)，mXG凝膠雖然可以起到很好的防粘連作用[12]，但不能抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生。因此，本研究將具有抗菌、抗炎作用的殼聚糖[13-14]，通過醚化反應(yīng)將羥丁基基團(tuán)引入殼聚糖分子鏈，制備水溶性的羥丁基殼聚糖(hydroxybutyl chitosan, HBC)，擬探究mXG/HBC復(fù)合可注射溫敏水凝膠對(duì)粘連松解術(shù)后二次損傷的預(yù)防作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)大鼠及主要試劑、儀器清潔級(jí)健康雄性SD大鼠110只，體重180～220 g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)大鼠中心。動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK-(京)2014-0004。所有大鼠在溫度(22±2)℃，相對(duì)濕度(50±5)%環(huán)境下單籠飼養(yǎng)，期間提供充足的水和飼料，實(shí)驗(yàn)前保證至少一周的適應(yīng)性飼養(yǎng)，術(shù)前12 h對(duì)大鼠禁食。mXG和HBC均由天津大學(xué)化工學(xué)院合成；醫(yī)用殼聚糖防粘連膜粘停寧(Film)購自煙臺(tái)萬利醫(yī)用品有限公司；等滲鹽水購自齊魯制藥有限公司；碘爾康購自上海利康消毒高科技有限公司。

1.2腹壁-盲腸粘連松解術(shù)后二次損傷粘連模型的建立選用110只SD大鼠建立腹壁-盲腸一次損傷模型。操作步驟：大鼠腹腔注射水合氯醛進(jìn)行麻醉，備皮、消毒、鋪手術(shù)洞巾。沿下腹部皮膚中心線開長度約5 cm的切口剪開腹壁。用手術(shù)刀在腹壁輕微磨刮，使之形成一個(gè)面積為1×2 cm2，深0.5 mm的出血區(qū)域。形成出血后在與腹壁創(chuàng)面相對(duì)應(yīng)的盲腸表面使用手術(shù)刷輕輕磨擦，直到盲腸漿膜層被破壞至有明顯的點(diǎn)狀出血，用5-0縫合線固定，使得創(chuàng)面與盲腸受損處完全的貼合，縫合關(guān)腹完成模型。術(shù)后1周，對(duì)大鼠進(jìn)行二次開腹手術(shù)，使用鈍器或銳器對(duì)形成的腹膜粘連進(jìn)行松解，用手術(shù)刷反復(fù)摩擦分離后的腹壁創(chuàng)面直至再次形成出血表面；然后用手術(shù)刷在分離后的盲腸創(chuàng)面部位輕輕磨擦，直到腸粘膜再次被破壞至有明顯的滲血，至此完成對(duì)粘連松解術(shù)后腹壁和盲腸的二次損傷模型的建立，關(guān)腹后使用碘爾康對(duì)傷口消毒。

1.3大鼠分組及處理在第一次損傷后發(fā)生粘連的大鼠中選擇80只粘連評(píng)分接近的大鼠，對(duì)其實(shí)施粘連松解術(shù)，并進(jìn)行二次損傷，隨機(jī)分為5組(每組16只)：對(duì)照組(等滲鹽水)、Film組(殼聚糖防粘連膜)、mXG組(注射4%，w/v改性木葡聚糖凝膠)、HBC組(注射5%，w/v羥丁基殼聚糖凝膠)、mXG/HBC組(注射4%/5%，w/v改性木葡聚糖/羥丁基殼聚糖復(fù)合凝膠)。對(duì)于mXG組、HBC組和mXG/HBC組，分別將1 mL溫敏凝膠注射至粘連松解術(shù)后二次損傷的腹壁和盲腸創(chuàng)面，待凝膠完全固化后關(guān)腹；對(duì)于Film組，將2×3 cm2的殼聚糖防粘連膜覆蓋于二次損傷的腹壁創(chuàng)面后關(guān)腹；對(duì)照組在關(guān)腹前將1 mL等滲鹽水注射于腹壁和盲腸的創(chuàng)面。

1.4溫敏水凝膠防粘連效果評(píng)分經(jīng)過7 d和14 d的正常飼養(yǎng)，通過腹腔注射過量水合氯醛分別處死各組中的大鼠，開腹后檢查腹壁與盲腸的粘連情況，并按照粘連的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)粘連進(jìn)行評(píng)分[15]。廣泛而致密的血管化粘連為5分，有不止一處的致密粘連為4分，有比較致密的粘連為3分，有不止一處的疏松粘連為2分，腹腔內(nèi)有一處薄的粘連為1分，完全無粘連為0分。實(shí)驗(yàn)采用雙盲設(shè)計(jì)，打分者不參與手術(shù)。

1.5溫敏水凝膠防粘連效果組織學(xué)評(píng)價(jià)對(duì)于粘連區(qū)域，切取腹壁-盲腸粘連部位的組織；對(duì)于未粘連的區(qū)域，分別切取腹壁和盲腸的創(chuàng)面組織，使用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，分別對(duì)同一部位進(jìn)行HE、Masson和Van Gieson染色后，使用光學(xué)顯微鏡觀察組織學(xué)形態(tài)。

2 結(jié) 果

2.1 溫敏水凝膠防粘連效果觀察術(shù)后7 d，對(duì)照組和Film組所有的大鼠盲腸和腹壁發(fā)生了明顯的粘連。mXG組僅1只輕微粘連，腹壁愈合創(chuàng)面面積較初始減小。HBC組所有大鼠均發(fā)生粘連。mXG/HBC組僅2只大鼠發(fā)生輕度粘連，腹壁創(chuàng)面已經(jīng)完全愈合，愈合創(chuàng)面表面光潔平整，新生間皮層已完全將創(chuàng)面覆蓋。見圖1。

圖示對(duì)照組、Film組和HBC組盲腸和腹壁發(fā)生了明顯的粘連，而mXG組和mXG/HBC組盲腸和腹壁沒有發(fā)生粘連黑色箭頭：盲腸和腹壁發(fā)生粘連；紅色箭頭：未發(fā)生粘連的盲腸；藍(lán)色箭頭：未發(fā)生粘連的腹壁

術(shù)后14 d，對(duì)照組所有大鼠形成粘連。Film組7只大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的粘連。mXG組僅2只大鼠輕度的粘連，腹壁和盲腸的創(chuàng)面均已完全愈合，沒有凝膠。HBC組所有大鼠均發(fā)生粘連。mXG/HBC組除1只有輕微粘連外，其余大鼠均未發(fā)生粘連，腹壁創(chuàng)面已經(jīng)完全愈合，愈合創(chuàng)面表面光潔平整。見圖2。

圖示對(duì)照組、Film組和HBC組盲腸和腹壁發(fā)生了明顯的粘連，而mXG組和mXG/HBC組盲腸和腹壁沒有發(fā)生粘連黑色箭頭：盲腸和腹壁發(fā)生粘連；紅色箭頭：未發(fā)生粘連的盲腸；藍(lán)色箭頭：未發(fā)生粘連的腹壁

2.2術(shù)后防粘連效果評(píng)分術(shù)后第7、14天時(shí)，與mXG組粘連評(píng)分比較，對(duì)照組、Film組明顯升高(P<0.05)；與mXG/HBC組比較，HBC組粘連評(píng)分明顯升高(P<0.05)。見表1。對(duì)照組在術(shù)后7 d所有的大鼠都發(fā)生了4-5分的嚴(yán)重粘連，14 d時(shí)大部分形成了5分粘連；Film組術(shù)后7 d的粘連主要集中在3-4分，14 d時(shí)大多形成4～5分的粘連；HBC組在7 d和14 d發(fā)生4～5分的嚴(yán)重粘連。術(shù)后7 d，mXG組、mXG/HBC組分別7、6只未發(fā)生粘連；術(shù)后14 d，mXG組、mXG/HBC組6、7只未發(fā)生粘連。

表1 術(shù)后防粘連效果評(píng)分分)

2.3防粘連效果組織學(xué)觀察術(shù)后第7天，對(duì)照組、Film組和HBC組大鼠腹壁和盲腸之間存在粘連，且粘連區(qū)域存在大量的膠原纖維，圖3虛線內(nèi)區(qū)域?yàn)樾纬傻闹旅芙Y(jié)締組織。mXG組腹壁和盲腸的創(chuàng)面組織恢復(fù)，但存在大量的炎性細(xì)胞和巨噬細(xì)胞滲出。mXG/HBC組無凝膠，愈合創(chuàng)面層次清晰、厚度均一、修復(fù)良好。見圖3。

術(shù)后14 d，對(duì)照組和HBC組粘連區(qū)域的膠原纖維沉積增多，厚度較第7天增加，粘連致密且部分區(qū)域有新生血管。HBC組粘連區(qū)域炎性細(xì)胞的數(shù)量減少。Film組粘連區(qū)域較第7天致密。mXG組新生間皮層下纖維蛋白沉積物減少，但創(chuàng)面表層不平整。mXG/HBC組盲腸和腹壁愈合表面平整，炎性細(xì)胞數(shù)量較第7天明顯減少，而且愈合創(chuàng)面組織變薄。見圖4。

圖示對(duì)照組、Film組和HBC組盲腸和腹壁發(fā)生了粘連，而mXG組和mXG/HBC組盲腸和腹壁沒有發(fā)生粘連

圖示對(duì)照組、Film組和HBC組盲腸和腹壁發(fā)生了粘連，而mXG組和mXG/HBC組盲腸和腹壁沒有發(fā)生粘連。

3 討 論

臨床研究顯示，粘連松解術(shù)后再粘連的發(fā)生率達(dá)50%[16-17]，直至目前腹腔術(shù)后粘連發(fā)生機(jī)制還未得到徹底的闡明，臨床上對(duì)粘連的防治手段仍存在許多不足，因此預(yù)防粘連的發(fā)生一直以來是腹部外科研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

感染是導(dǎo)致術(shù)后粘連的諸多因素之一[18]，尤其是對(duì)于腹腔損傷，由于創(chuàng)面暴露于富含大量腹腔液的潮濕環(huán)境中，極大地提高了細(xì)菌感染的概率，從而增加了術(shù)后粘連的發(fā)生率[19]。本課題組前期研究表明[10]，mXG凝膠具有優(yōu)良的“低溫溶膠，體溫凝膠”的溫敏特性，可產(chǎn)生較好的物理隔離作用，用于體內(nèi)后其降解產(chǎn)物對(duì)機(jī)體不產(chǎn)生毒性。本研究表明mXG凝膠具有良好的術(shù)后防粘連效果，但其本身不具有抗菌、抗炎性能[12]，而HBC凝膠具有抗菌、抗炎性能。因此，本課題組研究將兩種材料進(jìn)行共混得到mXG/HBC復(fù)合體系，通過大體觀察、粘連評(píng)分和組織學(xué)評(píng)價(jià)mXG/HBC復(fù)合凝膠的防粘連效果。

綜合粘連程度評(píng)分和大體觀察結(jié)果表明，術(shù)后7 d、14 d mXG組和mXG/HBC組中絕大對(duì)數(shù)的大鼠都沒有發(fā)生粘連，HBC組中，所有大鼠都發(fā)生4～5分的嚴(yán)重粘連，表明mXG和mXG/HBC復(fù)合凝膠能夠有效地預(yù)防粘連松解術(shù)后再次粘連的發(fā)生，而HBC凝膠對(duì)于粘連松解術(shù)后再次粘連的發(fā)生幾乎沒有起到預(yù)防的效果。

組織學(xué)觀察表明，對(duì)于mXG組，腹壁和盲腸的表層已經(jīng)出現(xiàn)了一層分布均勻、層次清晰的新生間皮層，同時(shí)在間皮細(xì)胞層下方出現(xiàn)纖維化組織，同時(shí)可見大量的炎性細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，表明mXG雖然有緩解腹腔粘連的作用，但不具有抗炎作用。對(duì)照組、Film組和HBC凝膠組中，粘連區(qū)域產(chǎn)生了大量的膠原纖維，14天時(shí)部分區(qū)域還可看到新生血管，而膠原纖維的大量沉積正是引發(fā)腹壁和盲腸創(chuàng)面形成粘連的關(guān)鍵，但HBC組中的炎癥反應(yīng)明顯低于mXG組，表明其具備抗炎作用。在mXG/HBC組中，腹壁愈合狀況非常好，表層出現(xiàn)了一層分布均勻且平整的新生間皮層，整個(gè)愈合的創(chuàng)面層次清晰，厚度均一盲腸的創(chuàng)面也得到一定程度的修復(fù)，表明mXG/HBC復(fù)合凝膠既可防治粘連形成，又具有減輕炎癥反應(yīng)的效果。

綜合分析可知，商業(yè)化防粘連膜在腹壁-盲腸粘連松解術(shù)后二次損傷粘連模型中雖然能夠在一定程度上減輕粘連的嚴(yán)重程度，但是并不能起到預(yù)防粘連的效果，這是因?yàn)閷⒎勒尺B膜用于二次損傷的創(chuàng)面時(shí)，它在創(chuàng)面滲血和腹腔液的作用下會(huì)很快變?yōu)檎吵淼娜芤籂顟B(tài)，不能有效的維持于創(chuàng)面發(fā)揮物理阻隔作用，從而導(dǎo)致了其難以有效地預(yù)防手術(shù)后的粘連。mXG凝膠因具有很高的強(qiáng)度(780 Pa)，可以有效的維持于創(chuàng)面發(fā)揮物理阻隔作用，HBC凝膠在用于術(shù)后防粘連時(shí)，除了能夠發(fā)揮物理屏障作用外，其復(fù)合凝膠還具有抑制成纖維細(xì)胞的增生、降低膠原纖維的產(chǎn)生以及促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長的作用，從而能夠促進(jìn)創(chuàng)面的愈合，減少粘連的發(fā)生；同時(shí)，HBC通過對(duì)一些生長因子的調(diào)控，還可以使膠原的分泌和沉積減少，在預(yù)防粘連的同時(shí)還減少了瘢痕的形成。此外，由于HBC還具有很好的抗菌活性，因此復(fù)合凝膠在用于術(shù)后防粘連時(shí)還能有效預(yù)防各種腹腔細(xì)菌所導(dǎo)致的感染，降低炎癥反應(yīng)的發(fā)生從而提高防粘連效果。

以上結(jié)果表明，mXG/HBC復(fù)合凝膠不僅能夠有效地預(yù)防粘連松解術(shù)后再次粘連的發(fā)生，還能降低炎癥反應(yīng)、促進(jìn)創(chuàng)面愈合，其為mXG/HBC復(fù)合凝膠今后應(yīng)用于臨床研究腹腔再粘連奠定了理論基礎(chǔ)并提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。