賈棋 樊秦凱 侯文清 楊晨光 王利邦王浩 徐春華 李明 陸穎?

1) (中國(guó)科學(xué)院物理研究所, 北京 100190)

2) (中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

DNA聚合酶是執(zhí)行DNA復(fù)制和修復(fù)的重要蛋白, 由于其只能從5′向3′方向聚合, 所以在聚合雙鏈DNA時(shí)會(huì)有兩種模式: 其一是先打開(kāi)DNA雙鏈, 讓其暴露出3′-5′方向的模板鏈(先導(dǎo)鏈), 然后沿著這條鏈復(fù)制出新鏈以此置換舊鏈, 這就是鏈置換的合成.另一種是沿著已經(jīng)置換出的5′-3′方向的模板鏈(滯后鏈)進(jìn)行延伸合成.T7噬菌體作為常被研究的模式生物, 其DNA聚合酶gp5在復(fù)制過(guò)程中既會(huì)參與鏈置換也會(huì)參與延伸合成, 已有的研究報(bào)道gp5自身獨(dú)立鏈置換的能力很弱, 其與T7解旋酶gp4耦合形成復(fù)制體后可以發(fā)生快速且持續(xù)的鏈置換, 這一現(xiàn)象的分子機(jī)制尚待厘清.本文通過(guò)單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移(smFRET)的方法對(duì)gp5聚合過(guò)程的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究, 發(fā)現(xiàn)gp5在沒(méi)有外力幫助下時(shí)會(huì)進(jìn)入鏈置換-外切的循環(huán), 導(dǎo)致聚合難以延伸, 調(diào)控這一循環(huán)的關(guān)鍵則是DNA雙鏈退火壓力.進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明gp5和gp4形成復(fù)制體后,gp4輔助gp5克服了退火壓力從而聚合可以延伸.

1 引 言

DNA復(fù)制過(guò)程中解旋酶和聚合酶會(huì)形成一個(gè)復(fù)制體先解開(kāi)DNA雙鏈讓其形成3′-5′方向先導(dǎo)鏈和5′-3′方向滯后鏈.在先導(dǎo)鏈上聚合酶聚合的方向和打開(kāi)DNA的方向是一致的, 所以會(huì)連續(xù)復(fù)制并且會(huì)置換出滯后鏈, 這種復(fù)制又被稱(chēng)為鏈置換.而滯后鏈上聚合酶聚合的方向與打開(kāi)DNA的方向相反, 只能打開(kāi)一段再合成一段導(dǎo)致其合成是不連續(xù)的進(jìn)而形成岡崎片段[1,2].由于DNA復(fù)制機(jī)制在各個(gè)物種間是高度保守的[1], 而T7噬菌體復(fù)制時(shí)所需蛋白非常簡(jiǎn)單, 僅由DNA聚合酶(gp5)、DNA解旋酶(gp4)及單鏈結(jié)合蛋白(gp2.5)組成,是一個(gè)良好的研究模型[3-5].形成復(fù)制體后gp5聚合酶有著高速合成DNA的能力, 其鏈置換速度在飽和的脫氧核糖三磷酸(100 μmol/L dNTP)下可以達(dá)到200個(gè)核苷酸(nt)每秒[6,7].gp4作為解旋酶, 其單獨(dú)解旋速度在飽和脫氧脫氧胸苷三磷酸(1 mmol/L dTTP)下只能達(dá)到20 nt每秒, 遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于gp5的速度[6-8].最近, 冷凍電鏡的研究發(fā)現(xiàn),gp5的前端有一個(gè)起到打開(kāi)DNA雙鏈效果的氨基酸二級(jí)結(jié)構(gòu)[9], 也就是說(shuō)gp5自身具有打開(kāi)雙鏈的能力.又有報(bào)道顯示gp5如果沒(méi)有g(shù)p4的幫助就難以進(jìn)行鏈置換[7,10].因此, 聚合酶在先導(dǎo)鏈上鏈置換過(guò)程的分子機(jī)制值得研究.

有研究者通過(guò)單分子磁鑷的方式對(duì)DNA雙鏈?zhǔn)┘哟笥? pN的拉力時(shí), gp5可以持續(xù)鏈置換但是也有持續(xù)外切的現(xiàn)象, 而將外力變小, 持續(xù)外切的情況就會(huì)更加頻繁導(dǎo)致gp5難以鏈置換[11].這一結(jié)果說(shuō)明了gp5可以獨(dú)自鏈置換, 但是新合成的堿基又會(huì)被外切掉.由于技術(shù)局限, 磁鑷無(wú)法在完全沒(méi)有力作用下(生理?xiàng)l件下)對(duì)gp5的鏈置換和外切進(jìn)行測(cè)量, 這也留下了疑問(wèn): gp5在沒(méi)有力作用下, 有無(wú)一定程度的鏈置換及外切的現(xiàn)象.

這里我們使用單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移(smFRET)的方法在一個(gè)沒(méi)有力的生理?xiàng)l件下, 并在一個(gè)接近單核苷酸尺度的分辨率下對(duì)gp5的鏈置換動(dòng)力學(xué)進(jìn)行測(cè)量.本工作發(fā)現(xiàn)即使沒(méi)有外力的幫助, gp5也可以鏈置換, 但是鏈置換到4 nt左右后就會(huì)回退.通過(guò)突變掉外切活性的蛋白, 證明了這種回退是外切導(dǎo)致的.為了證明退火壓力對(duì)gp5的影響, 本文使用了納米張力器的FRET方法,對(duì)DNA雙鏈?zhǔn)┘恿艘粋€(gè)微小的力[12,13], 以此來(lái)減弱DNA雙鏈的退火壓力.施加力后外切的長(zhǎng)度減小、鏈置換的長(zhǎng)度提高了.進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)gp4和gp5形成了復(fù)制體后合成速度會(huì)有一定升高, 而其最主要的特征是不再有外切的出現(xiàn).這說(shuō)明了gp4幫助gp5克服了DNA的退火壓力, 從而減少了gp5外切的發(fā)生.

2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 聚丙烯酰胺電泳凝膠實(shí)驗(yàn)步驟

首先配置12%聚丙烯酰胺電泳凝膠: 48 g尿素, 30 mL 40%丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺(19∶1)溶液, 10 mL 10 × TBE, H2O(補(bǔ)足100 mL), 10%APS 700 μL, TEMED 66 μL.配置好后在電泳儀上以400 V的電壓預(yù)跑30 min.在這一過(guò)程中準(zhǔn)備電泳的樣品, 分別是樣品1: 10 nmol/L DNA;樣品2: 加入40 nmol/L DNA, 40 nmol/L gp5,100 μmol/L dNTP, 1 mmol/L二 硫 疏 糖 醇 在37 ℃水浴反應(yīng)1 min后用100 mmol/L EDTA終止反應(yīng); 樣品3: 使用exo—gp5, 其余和樣品2一樣; 樣品4: 和樣品2一樣, 但是反應(yīng)時(shí)間為5 min;樣品5: 和樣品3一樣, 但是反應(yīng)時(shí)間為5 min.然后將5個(gè)樣品加入不同的條帶處進(jìn)行3 h的電泳,最后用凝膠成像儀分析條帶位置.

2.2 單分子實(shí)驗(yàn)玻片的清洗與修飾

首先使用丙酮、甲醇、食人魚(yú)洗液(濃硫酸+雙氧水)對(duì)玻片進(jìn)行深度清潔, 接著使用硅烷化試劑進(jìn)行修飾, 最后使用100∶1的mPEG和biotin-PEG經(jīng)行修飾.詳情可以見(jiàn)參考文獻(xiàn)[14].

2.3 單分子熒光共振能量實(shí)驗(yàn)步驟

首先將上訴的玻片用雙面膠粘成具有不同通道的樣品池, 接著加入鏈酶親和素連接波片的biotin-PEG, 然后加入100 pmol/L DNA, 最后加入1 nmol/L gp5和4 μmol/L dNTP, 收集Cy3和Cy5的光強(qiáng)信息, 并以此計(jì)算熒光轉(zhuǎn)移效率.對(duì)于gp5和gp4一起加入的實(shí)驗(yàn)過(guò)程為, 先體外孵育1 nmol/L gp5, 20 nmol/L gp4和100 μmol/L dTTP形成復(fù)合體再加入到樣品池中.

2.4 蛋白和緩沖液

gp5購(gòu)買(mǎi)于NEB公司, exo—gp5購(gòu)買(mǎi)于GE health公司.gp4按照文獻(xiàn)[15]的方法純化得到.dNTP購(gòu)買(mǎi)于Takara公司.DNA購(gòu)買(mǎi)于上海生工公司, 退火的方法詳見(jiàn)文獻(xiàn)[16].實(shí)驗(yàn)時(shí)的緩沖體系為: 50 mmol/L NaCl, 20 mmol/L pH為7.9的Tris緩沖液, 10 mmol/L MgCl2, 1 mmol/L DTT.

3 結(jié)果與討論

3.1 外切活性對(duì)gp5鏈置換的影響

之前的文獻(xiàn)認(rèn)為持續(xù)外切是導(dǎo)致gp5無(wú)法鏈置換的原因[11], 為了直接證明這一點(diǎn), 本文使用突變了外切活性的exo—gp5作為對(duì)照組實(shí)驗(yàn)(為了區(qū)分, 在后續(xù)的結(jié)果與討論部分, 把沒(méi)有突變的野生型gp5寫(xiě)作exo+gp5), 并建立了如圖1(a)所示的DNA, 其引物鏈末端標(biāo)記了Alexa488, 而變性聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)被用來(lái)分離這些引物鏈,最后使用488 nm激光照明就可以特異性地得到引物鏈的長(zhǎng)度, 進(jìn)而得知DNA聚合酶的鏈置換情況.通過(guò)對(duì)比exo+gp5和exo—gp5反應(yīng)產(chǎn)物, 從圖1(b)電泳結(jié)果的第3道中可以發(fā)現(xiàn)在1 min的時(shí)間內(nèi)exo—gp5大部分產(chǎn)物都被全部鏈置換了,只有極少數(shù)留在原來(lái)的位置, 相反的是, 在圖1(b)電泳結(jié)果的第2道中exo+gp5只有極少數(shù)全部被鏈置換.不僅如此, exo+gp5還外切了一些原有DNA.通過(guò)在圖1(b)電泳結(jié)果第4道和第5道中展示的延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間后的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn): 所有exo—gp5都全部合成了, 但是exo+gp5仍然只有很少的全長(zhǎng)延伸產(chǎn)物.從聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)的結(jié)果可以得知, exo+gp5是一個(gè)雙向的馬達(dá), 它既可以鏈置換也可以外切, 但是由于外切活性的存在導(dǎo)致了其鏈置換能力很弱, 甚至?xí)言械腄NA外切的更短.而如果突變了外切活性, exo—gp5可以獨(dú)立的打開(kāi)DNA雙鏈并進(jìn)行合成.由于PAGE實(shí)驗(yàn)只展示了最后的結(jié)果, 無(wú)法看到exo+gp5在鏈置換與外切中切換的動(dòng)態(tài)過(guò)程, 也就無(wú)法測(cè)量exo+gp5單次鏈置換和外切的長(zhǎng)度和速度,所以我們使用了單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法[17,18]來(lái)實(shí)時(shí)觀測(cè)其轉(zhuǎn)化的方式和原因.

圖1 exo+ gp5和exo— gp5的PAGE實(shí)驗(yàn) (a)電泳實(shí)驗(yàn)的DNA, 在引物鏈5′端標(biāo)記有Alexa488; (b) 對(duì)Alexa488照明得到的結(jié)果: 第1個(gè)條帶為DNA的原始長(zhǎng)度, 第2個(gè)條帶是exo+ gp5合成1 min后的結(jié)果, 第3個(gè)條帶是exo— gp5合成1 min后的結(jié)果, 第4個(gè)條帶是exo+ gp5合成5 min后的結(jié)果, 第5個(gè)條帶是exo— gp5合成5 min后的結(jié)果Fig.1.PAGE assays of exo+ gp5 and exo— gp5.(a) Illustration of DNA that used in PAGE assays.Alexa488 is labeled on the 5′ overhand of primer DNA.(b) Results of various condition.The first lane: Original length of the DNA.The second lane: The synthesis-product of exo+ gp5 with 1 minute.The third lane: The synthesis-product of exo—gp5 with 1 minute.The fourth lane: The synthesis-product of exo+ gp5 with 5 minute.The fifth lane: The synthesisproduct of exo— gp5 with 5 minute.

3.2 gp5外切與鏈置換的動(dòng)態(tài)過(guò)程

構(gòu)建了如圖2(a)所示的Y型DNA, 通過(guò)標(biāo)記在DNA不同單鏈上的Cy3和Cy5來(lái)進(jìn)行測(cè)量DNA聚合酶鏈置換的長(zhǎng)度和速度.當(dāng)DNA聚合酶打開(kāi)DNA雙鏈時(shí), Cy3和Cy5的距離會(huì)變遠(yuǎn),進(jìn)而導(dǎo)致能量轉(zhuǎn)移效率FRET降低, 相反當(dāng)DNA聚合酶回退時(shí), FRET就會(huì)增加.因?yàn)镕RET和距離的關(guān)系為6次方, 所以這種方法可以達(dá)到2—3 ?的精度.

之前報(bào)道中發(fā)現(xiàn)輔助因子Trx會(huì)幫助exo+gp5結(jié)合DNA, 進(jìn)而延長(zhǎng)exo+gp5在延伸時(shí)的合成長(zhǎng)度, 使其從數(shù)十nt的量級(jí)變到數(shù)百nt的量級(jí)[19].圖2(a)和圖2(b)展示了不加入Trx的對(duì)照組實(shí)驗(yàn)結(jié)果, exo+gp5幾乎無(wú)法鏈置換, 而從圖2(c)和圖2(d)可以看出加入Trx后exo+gp5可以打開(kāi)DNA雙鏈進(jìn)行鏈置換, 進(jìn)而使得FRET下降,但是FRET下降到一定長(zhǎng)度后就會(huì)發(fā)生回退.這里我們對(duì)曲線(xiàn)中每次下降的長(zhǎng)度(synthesis processivity)進(jìn)行統(tǒng)計(jì), 通過(guò)擬合可以發(fā)現(xiàn)下降長(zhǎng)度的分布是單e指數(shù)分布, 其分布的平均長(zhǎng)度 〈 processivity 〉 = 0.26 ± 0.03 (圖2(g)).根據(jù)文獻(xiàn)[17]結(jié)果在不加力時(shí)ΔFRET = 0.07約為1 nt, 也就可以將下降的平均長(zhǎng)度換算為約3.7個(gè)核苷酸.在之前的工作[11]中認(rèn)為只有大于8 pN才有合成的出現(xiàn), 而在4 pN時(shí)只有外切被發(fā)現(xiàn), 這可能是其精度所限導(dǎo)致的, 無(wú)法看到這種短片段的鏈置換.本工作進(jìn)一步對(duì)其鏈置換速度進(jìn)行分析(鏈置換長(zhǎng)度/時(shí)間), 發(fā)現(xiàn)其速度即使在低濃度dNTP(4 μmol/L)也可以達(dá)到8 nt/s (圖4(d)), 這些現(xiàn)象說(shuō)明exo+gp5獨(dú)自鏈置換的速度是很快的, 但是容易回退.為了直接研究這種回退到底是什么導(dǎo)致的, 采用突變了外切結(jié)構(gòu)域的exo—gp5作為對(duì)照組進(jìn)行了smFRET實(shí)驗(yàn), 從圖2(e)和圖2(f)可以發(fā)現(xiàn)在exo—gp5的實(shí)驗(yàn)中幾乎就沒(méi)有回退的現(xiàn)象, 這說(shuō)明了回退的確是外切導(dǎo)致的.之前的單分子文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶在鏈置換時(shí)有持續(xù)外切的現(xiàn)象, 但是由于都是在施加外力的情況下發(fā)現(xiàn)的, 所以可能無(wú)法證實(shí)沒(méi)有力的情況下是否還有持續(xù)外切[11,20,21].我們對(duì)曲線(xiàn)中每次回退的長(zhǎng)度(excision processivity)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì), 從圖2(h)的擬合可以發(fā)現(xiàn)其長(zhǎng)度的分布也是單e指數(shù)衰減的,平均長(zhǎng)度為0.24 ± 0.03, 換算后就是在3.4 nt左右, 這一現(xiàn)象驗(yàn)證了即使沒(méi)有外力的介入, exo+gp5在鏈置換時(shí)也有持續(xù)外切的現(xiàn)象.通過(guò)這些實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn), gp5鏈置換到4 nt左右時(shí), exo+gp5就開(kāi)始外切, 而由于鏈置換和外切的長(zhǎng)度差不多,聚合酶此時(shí)進(jìn)入了鏈置換-外切的循環(huán)中無(wú)法真正的進(jìn)行鏈置換.本文也發(fā)現(xiàn)如果外切活性突變后,聚合酶就可以一直鏈置換, 但是沒(méi)有了外切活性,聚合酶的復(fù)制保真度會(huì)大大降低, 導(dǎo)致生命復(fù)制的錯(cuò)誤率增加.

圖2 T7 DNA聚合酶gp5不斷重復(fù)鏈置換和外切 (a), (b)沒(méi)有結(jié)合輔助因子Trx時(shí)聚合酶無(wú)法鏈置換DNA雙鏈; (c), (d)有輔助因子Trx時(shí)聚合酶能夠部分鏈置換DNA, 但是會(huì)回退; (e), (f)外切活性突變后的gp5不會(huì)再外切; (g) exo+ gp5 + Trx實(shí)驗(yàn)中合成長(zhǎng)度的統(tǒng)計(jì)圖, 其分布滿(mǎn)足單e指數(shù); (h) exo+ gp5 + Trx實(shí)驗(yàn)中外切長(zhǎng)度的統(tǒng)計(jì)圖, 其分布滿(mǎn)足單e指數(shù)Fig.2.T7 DNA polymerase gp5 repeats in synthesis-excision cycle: (a), (b) exo+ gp5 cannot have displacement synthesis without co-factor Trx; (c), (d) gp5 with Trx repeats in synthesis-excision cycle; (e), (f) exo— gp5 attain full-length displacement synthesis without excision; (g) histogram of synthesis processivity from assay of exo+ gp5 + Trx, the distribution is well fit by an exponential;(h) histogram of excision processivity from assay of exo+ gp5+ Trx, the distribution is well fit by an exponential.

3.3 力對(duì)野生型gp5鏈置換長(zhǎng)度的影響

通常認(rèn)為聚合酶的外切功能只會(huì)切除錯(cuò)誤的核苷酸, 而exo+gp5只有萬(wàn)分之一的概率插入錯(cuò)誤的核苷酸[22], 所以鏈置換過(guò)程中的外切不全是錯(cuò)誤導(dǎo)致的.上面的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)外切是要exo+gp5鏈置換到一定程度后才會(huì)明顯出現(xiàn)的, 鏈置換的過(guò)程伴隨的是舊雙鏈退火壓力.為了證明是力改變了exo+gp5的模式, 我們通過(guò)圖3(a)所示的納米張力器來(lái)研究力對(duì)外切的影響.納米張力器的原理是通過(guò)一段彎曲的雙鏈DNA來(lái)對(duì)需要鏈置換的DNA施加張力, 這個(gè)張力大概在5—6 pN左右,而此時(shí)根據(jù)計(jì)算[12]ΔFRET = 0.11為1 nt, 也就對(duì)實(shí)驗(yàn)精度有進(jìn)一步的提高.通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)張力加到DNA上后, 聚合酶鏈置換長(zhǎng)度和外切長(zhǎng)度仍然是單e指數(shù)衰減的分布(圖3(c)和圖3(d)),經(jīng)過(guò)換算后, 聚合酶的速度稍微有提高到9 nt/s(圖3(b)和圖4(d)), 而外切的平均長(zhǎng)度變?yōu)?.9 nt,比不加力的情況稍微變小, 這意味著外切程度變低了.另一方面聚合酶的鏈置換平均長(zhǎng)度變?yōu)榱?.9 nt, 比不加力變長(zhǎng)了, 但是這種變長(zhǎng)仍然無(wú)法完全鏈置換, 這說(shuō)明了在6 pN的外力幫助下, gp5仍然無(wú)法克服退火壓力的影響.

圖3 T7 DNA聚合酶gp5外切的原因是退火壓力 (a)納米張力器示意圖; (b) 納米張力器實(shí)驗(yàn)的典型曲線(xiàn); (c) exo+ gp5 +Trx在受力后合成長(zhǎng)度的統(tǒng)計(jì)圖, 其分布滿(mǎn)足單e指數(shù); (d) exo+ gp5 + Trx受力后外切長(zhǎng)度的統(tǒng)計(jì)圖, 其分布滿(mǎn)足單e指數(shù)Fig.3.DNA regression pressure induced exonuclease activity: (a) Illustration of nanotensionior; (b) typical trace from assay of nanotensionior; (c) histogram of synthesis processivity from assay of exo+ gp5 + Trx with tension, the distribution is well fit by an exponential; (d) histogram of excision processivity from assay of exo+ gp5 + Trx with tension, the distribution is well fit by an exponential.

3.4 解旋酶幫助聚合酶克服了退火壓力解旋酶對(duì)聚合酶鏈置換的影響

我們之前的工作發(fā)現(xiàn)單獨(dú)加入gp4解旋速度是很慢的[16], 而單獨(dú)加入exo+gp5就無(wú)法完全鏈置換.為了研究復(fù)制體鏈置換的情況, exo+gp5,Trx和gp4以及dTTP被體外孵育好后加入到反應(yīng)池中(圖4(a)), 通過(guò)圖4(b)所示曲線(xiàn)可發(fā)現(xiàn)鏈置換速度變快了而且也沒(méi)有外切的出現(xiàn).由圖4(d)可知, 復(fù)制體的速度(14 nt/s)快于聚合酶單獨(dú)的速度(8 nt/s), 而加入gp4后最大的特點(diǎn)就是聚合酶不再回退(圖4(c)).這說(shuō)明了聚合酶打開(kāi)雙鏈后, 由于解旋酶阻擋了退火壓力, 聚合酶可以持續(xù)鏈置換而不會(huì)外切, 這就使得兩者配合在一起, 解旋酶阻擋聚合酶不再外切, 而聚合酶幫助解旋酶打開(kāi)雙鏈.這里值得注意的是, 外切對(duì)于聚合酶的保真度是有很大幫助的[23,24], 在加入gp4后不再出現(xiàn)外切,這雖然提高了合成效率但是可能降低了保真度.

圖4 T7 DNA解旋酶幫助聚合酶克服退火壓力 (a) gp4, exo+ gp5和Trx共同鏈置換的示意圖, (b) gp4, exo+ gp5和Trx共同鏈置換時(shí)的典型曲線(xiàn); (c) exo+ gp5 + Trx + gp4可以完全鏈置換; (d)不同情況的鏈置換速度Fig.4.gp4 decrease DNA regression pressure which facilitate gp5 to attain processive strand-displacement synthesis: (a) Illustration of displacement by gp4, exo+ gp5 and Trx; (b) typical trace from assay of gp4, exo+ gp5 and Trx; (c) exo+ gp5 + Trx +gp4 attain processive synthesis; (d) synthesis speed in various condition.

3.5 聚合酶鏈置換的機(jī)制

如圖5(a)所示單獨(dú)的聚合酶面對(duì)DNA雙鏈時(shí), 能夠打開(kāi)雙鏈, 但是其合成長(zhǎng)度非常的低, 其原因在于退火壓力的出現(xiàn), 這種壓力使得聚合酶無(wú)法在打開(kāi)雙鏈后順利插入核苷酸只能進(jìn)行外切的反應(yīng), 而外切一旦開(kāi)始就會(huì)持續(xù)3—4 nt左右導(dǎo)致過(guò)度外切的出現(xiàn), 當(dāng)外切完后聚合酶又進(jìn)入了鏈置換模式.單獨(dú)的聚合酶就會(huì)一直陷入這種聚合-外切循環(huán).但是有了解旋酶加入后, 如圖5(b)所示解旋酶幫助聚合酶承受了退火壓力, 使得聚合酶可以鏈置換.另一方面由于聚合酶打開(kāi)雙鏈的能力很強(qiáng), 這也就幫助了解旋酶進(jìn)行解旋.這種互相配合使得復(fù)制體可以快速地進(jìn)行鏈置換.

圖5 T7 DNA聚合酶不同情況鏈置換時(shí)的模型 (a) 野生型gp5單獨(dú)鏈置換時(shí)進(jìn)入鏈置換和外切的循環(huán); (b) 野生型gp5在gp4的幫助下, 沒(méi)有外切的出現(xiàn)可以持續(xù)鏈置換Fig.5.Model for gp5 strand displacement activity in various condition: (a) exo+ gp5 repeats in synthesis-excision cycle; (b) gp4 facilitate exo+ gp5 to attain processive strand-displacement synthesis.

之前的文獻(xiàn)證明聚合酶和解旋酶不是一直同步進(jìn)行的, 而是會(huì)有脫耦的出現(xiàn)[25].這些情況都需要野生型gp5本身有一定的鏈置換能力, 在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)野生型gp5能夠獨(dú)立鏈置換4 nt左右才容易外切, 也就是說(shuō)野生型gp5和gp4之間可以存在4 nt的脫耦而不影響復(fù)制體的合成.之前我們的工作也發(fā)現(xiàn)了gp4的解旋甚至有換鏈的情況[26],這種情況也說(shuō)明了需要野生型gp5具有一定的獨(dú)立鏈置換能力, 否則DNA的復(fù)制就會(huì)完全停止.

4 結(jié) 論

本工作使用smFRET的方法發(fā)現(xiàn)gp5能夠獨(dú)自鏈置換, 但是其鏈置換4個(gè)核苷酸后就會(huì)由于退火壓力的影響, 進(jìn)而外切核苷酸.有趣的是這種外切是有持續(xù)性的, 過(guò)度的外切會(huì)降低合成的效率.當(dāng)對(duì)DNA施加力來(lái)抵抗退火壓力后, gp5合成的會(huì)變長(zhǎng), 外切會(huì)變短, 這說(shuō)明了gp5的外切活性是受力調(diào)控的, 力越大越不容易出現(xiàn)外切.而加入解旋酶后, 幫助聚合酶克服了退火壓力, 使得聚合酶可以一直合成核苷酸.這種獨(dú)特的模式使得gp5, gp4的協(xié)同下可以快速的進(jìn)行鏈置換.