高銘，鄭沾福，劉興華，林泳煌，周萍，何玉清，3

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室，廣東 東莞 523808；2.東莞市婦幼保健院兩癌篩查中心，廣東 東莞 523000；3.廣東醫(yī)科大學(xué)寮步醫(yī)院皮膚科，廣東 東莞 523400)

宮頸癌是世界第四大常見的女性惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率極高。2018年有56.9萬例宮頸癌新發(fā)病例，占當(dāng)年所有新發(fā)癌癥病例的3.2%[1]。目前已明確高危型人乳頭瘤病毒持續(xù)或反復(fù)感染是宮頸鱗狀上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)以及宮頸癌發(fā)生發(fā)展的主要原因，大多數(shù)宮頸人乳頭瘤病毒感染能自行清除，但少數(shù)持續(xù)性感染會導(dǎo)致嚴(yán)重的不典型增生，最終導(dǎo)致浸潤性癌癥[2]。按照1～3等級對CIN進(jìn)行分級，CIN 1級相當(dāng)于宮頸低級別鱗狀上皮內(nèi)病變，有發(fā)展為≥CIN 2級的風(fēng)險(xiǎn)；CIN 2級和CIN 3級則是高級別鱗狀上皮內(nèi)病變(high-grade squamous intraepithelial lesions，HSIL)，≥CIN 2級有發(fā)展為宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)，CIN 3級是可能發(fā)展為宮頸浸潤癌的等級[3]。目前HISL的主要治療方式為盡可能保留生育功能的宮頸錐切術(shù)，但術(shù)后仍有較高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。研究表明，CIN 2～3級治療后約17%的婦女有殘留或可能發(fā)展為復(fù)發(fā)性CIN 2～3級[4-6]，還有部分HSIL發(fā)展為宮頸浸潤癌。因此，鑒定新的生物標(biāo)志物以及早期篩查診斷尤為重要，可以極大地降低患者后期惡化情況，提高患者生活質(zhì)量，保護(hù)患者的心理健康。

鑒定基因特異性表達(dá)模式可用于了解CIN、宮頸癌在內(nèi)的多種疾病的致病機(jī)制，為診斷和治療預(yù)后評估提供新策略[7-8]。魯棒秩聚合法(robust rank aggretation，RRA)已用于基于多種疾病(如癌癥、自身免疫性疾病)的多個(gè)數(shù)據(jù)集篩選差異表達(dá)圖譜[9-11]，RRA是一種利用概率模型對排序列表進(jìn)行整合的方法[12]，已有多項(xiàng)研究表明其是一種可靠的多組芯片數(shù)據(jù)集整合分析方法[11,13-15]。本研究旨在采用生物信息學(xué)的手段分析多數(shù)據(jù)集獲得差異表達(dá)基因并構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)，鑒定與HSIL發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的核心基因，進(jìn)而識別新的生物標(biāo)志物以及潛在的藥物治療靶點(diǎn)，為HSIL的研究提供新思路。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)來源 從GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)下載HISL的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。以“CIN”“HISL”“Gene expression”“Homo sapiens ”“Microarray”為檢索詞搜索微陣列研究。HSIL的基因表達(dá)數(shù)據(jù)集標(biāo)準(zhǔn)篩選：①實(shí)驗(yàn)樣本均來源于宮頸組織；②HSIL組和對照組(正常宮頸組織)的樣本數(shù)量均≥5個(gè)；③GEO提供了原始數(shù)據(jù)或通過陣列能進(jìn)行基因表達(dá)譜分析。

1.2數(shù)據(jù)集的預(yù)處理和差異性基因表達(dá)分析 從GEO數(shù)據(jù)庫下載每個(gè)陣列數(shù)據(jù)集的基因表達(dá)矩陣和相關(guān)注釋文檔，使用對應(yīng)的注釋文檔將微陣列探針映射到基因符號。如果多個(gè)探針映射到同一符號，則采用平均值表示。為消除樣品之間的個(gè)體差異，將4個(gè)微陣列數(shù)據(jù)集進(jìn)行分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化。采用“l(fā)imma”(用于微陣列數(shù)據(jù)的線性模型)R包進(jìn)行分析，獲得每個(gè)微陣列中宮頸HISL組織與正常對照宮頸組織之間的差異表達(dá)基因列表，保存上調(diào)和下調(diào)的基因列表，確定差異表達(dá)基因的閾值標(biāo)準(zhǔn)為|log2FC|>1和校正后P<0.05。

1.3RRA整合分析 采用RRA識別可靠的差異基因。在進(jìn)行RRA分析前，獲得每個(gè)數(shù)據(jù)集的上調(diào)和下調(diào)基因列表，這些基因列表是由HSIL組和對照組的表達(dá)倍數(shù)變化產(chǎn)生,然后通過“RobustRankAggregation”R包比較多個(gè)排名的基因列表。RRA分析中校正后的P值表明每個(gè)基因在最終基因列表中排名靠前的可能性。P<0.05和差異倍數(shù)變化>0.5 的基因則為差異顯著基因。

1.4信號通路富集分析 利用R包c(diǎn)lusterProfiler[16]及ReactomePA[17]分別對差異基因進(jìn)行基因本體(Gene Ontology，GO)功能注釋及京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，以P<0.05和Q<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選顯著的功能注釋及通路富集結(jié)果。

1.5蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein protein interaction network，PPI network)構(gòu)建與分析 使用STRING數(shù)據(jù)庫(http://www.string-db.org,version:11.0)，置信度標(biāo)準(zhǔn)為>0.4構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。采用Cytoscape(version:3.71)軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)可視化，使用MCODE插件鑒定整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中的核心模塊，并用Cytohubba插件識別整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵基因(Hub基因)。在Cytoscape中，每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)基因或蛋白質(zhì)，節(jié)點(diǎn)之間的邊緣代表分子之間的相互作用。

2 結(jié) 果

2.1基因芯片信息 根據(jù)先前確定的納入標(biāo)準(zhǔn)，篩選出了4個(gè)符合本研究的芯片數(shù)據(jù)，包括GSE63514、GSE7803、GSE26278、GSE138080，每個(gè)數(shù)據(jù)集的具體信息見表1。本研究共納入分析161個(gè)樣品，其中包含56個(gè)正常對照和105個(gè)HSIL樣本。

2.2差異性基因表達(dá)分析 根據(jù)截止標(biāo)準(zhǔn)(log2FC>1，校正后的P<0.05)，按照表1的分組進(jìn)行差異表達(dá)分析，使用“l(fā)imma”R軟件包篩選出差異表達(dá)基因。結(jié)果顯示：GSE63514數(shù)據(jù)集獲得了1 956個(gè)差異表達(dá)基因(1 315個(gè)上調(diào)基因，641個(gè)下調(diào)基因)；GSE27678數(shù)據(jù)集獲得了1 022 個(gè)差異表達(dá)基因(567個(gè)上調(diào)基因，455個(gè)下調(diào)基因)；GSE7803數(shù)據(jù)集獲得了747個(gè)差異表達(dá)基因(372個(gè)上調(diào)基因，375 個(gè)下調(diào)基因)；GSE138080數(shù)據(jù)集獲得了1 023個(gè)差異表達(dá)基因(344個(gè)上調(diào)基因，679個(gè)下調(diào)基因)。4個(gè)微陣列的火山圖見圖1。

2.3RRA綜合分析的結(jié)果 使用“Robust Rank Aggeretation”R包分析排序好的4個(gè)微陣列的差異表達(dá)基因，確定了175個(gè)重要的差異表達(dá)基因(上調(diào)77個(gè)，下調(diào)98個(gè))，其中前10個(gè)上調(diào)和前11個(gè)下調(diào)基因的熱圖見圖2。

2.4信號通路富集分析 通過clusterProfiler[16]包對175個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果顯示主要富集在細(xì)胞分化、免疫反應(yīng)、炎癥、代謝等功能類別上，見圖3。KEGG富集結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因主要富集在補(bǔ)體和凝血級聯(lián)、花生四烯酸代謝、炎癥、前列腺癌、膀胱癌、細(xì)胞周期、白細(xì)胞介素-17、腫瘤壞死因子、AMP活化蛋白激酶信號通路上，見圖4。

GO：基因本體

KEGG：京都基因與基因組百科全書

2.5PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建以及Hub基因鑒定 對175個(gè)基因進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，包含132個(gè)節(jié)點(diǎn)，421條邊，見圖5a。通過Cytoscape軟件進(jìn)行可視化，使用MOCE插件提取1個(gè)關(guān)鍵模塊，得到10個(gè)關(guān)鍵基因：基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)、金屬蛋白酶2組織抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinase 2，TIMP2)、CXC趨化因子配體1[chemokine(C-X-C motif)ligand 1，CXCL1]、胞嘧啶脫苷酶(cytidine deaminase，CDA)、親珠蛋白(haptoglobin，HP)、乳鐵蛋白(lactotransferrin，LTF)、嗅覺素-4(olfactomedin 4，OLFM4)、富含半胱氨酸的分泌蛋白3(cysteine-rich secretory protein 3，CRISP3)、胱抑素B(cystatin B，CSTB)、胰蛋白酶3(protease,serine 3，PRSS3)，見圖5b。應(yīng)用Cytohubba插件中MCC和DMNC兩種算法提取連接最多的前10個(gè)基因并取其交集，得到4個(gè)核心基因：LTF、CSTB、CRISP3、CDA，見圖5c。其中CXCL1、LTF在RRA法中TOP10的差異表達(dá)基因中。綜合分析，最終確定5個(gè)核心基因：細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A(cyclin-dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A)、富半胱氨酸的C端1(cysteine rich C-terminal 1，CRCT1)、CXCL1、LTF、CDA。

5a：Cytoscape可視化PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(其中紅色為上調(diào)基因，綠色為下調(diào)基因)；5b：提取的基因模塊；5c：Cytohubba兩種算法提取前10個(gè)基因的韋恩圖；PPI：蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

3 討 論

高危型人乳頭瘤病毒持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸低級別鱗狀上皮內(nèi)病變、HSIL和浸潤性宮頸癌發(fā)生的主要原因。HISL如果不能被早期發(fā)現(xiàn)和治療可能繼續(xù)發(fā)展為浸潤性宮頸癌。隨著宮頸癌篩查的推廣以及宮頸癌疫苗的接種，目前宮頸癌的發(fā)病率有所下降，但HSIL治療后的復(fù)發(fā)仍是臨床較難解決的問題。因此，對HSIL惡變前的診治顯得尤為重要。本研究的目的是篩選和鑒定與HISL密切相關(guān)的基因生物標(biāo)志物，為臨床早期篩查和治療預(yù)后提供科學(xué)的理論依據(jù)。

PPI分析中節(jié)點(diǎn)之間的連接能被可視化，以鑒定HSIL中差異表達(dá)基因編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用，位于中心節(jié)點(diǎn)的基因被認(rèn)為是可能起關(guān)鍵作用的Hub基因，Hub基因通常被認(rèn)為是參與整個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并有生物學(xué)功能的關(guān)鍵基因。本研究通過RRA聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)拓?fù)洚悩?gòu)結(jié)構(gòu)對多個(gè)芯片進(jìn)行綜合分析，成功鑒定了5個(gè)核心基因，其中CDKN2A、CXCL1兩個(gè)基因已有研究發(fā)現(xiàn)[18-21]與HSIL有直接或間接的關(guān)聯(lián)，CDKN2A、CXCL1可能通過細(xì)胞周期、p53、白細(xì)胞介素-17和腫瘤壞死因子等癌癥相關(guān)信號來靶向調(diào)控HSIL的發(fā)展進(jìn)程。CDKN2A也稱為p16INK4A，是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)抑制劑，可阻斷CDK4和CDK6介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄共加壓子的磷酸化，抑制E2F依賴的轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞周期進(jìn)程[22]。多項(xiàng)研究證實(shí)，幾乎在所有HSIL病例中均可以檢測到CDKN2A，其表達(dá)水平與宮頸進(jìn)展的病變程度呈正相關(guān)[19]，具有較高的檢測特異性和敏感性，可作為HSIL的早期篩查和預(yù)后標(biāo)志物[20-21]。CXCL1是一類具有促細(xì)胞分裂和促血管生成活性的趨化因子,常與炎癥、感染、細(xì)胞免疫相關(guān)，在多種癌癥中表達(dá)上調(diào)[23-24]，可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、存活、新血管生成和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，CXCL1在不同級別的宮頸病變(CIN 1、2、3級)中差異表達(dá)，且其表達(dá)水平與病變級別呈正相關(guān)，可作為檢測HSIL的生物標(biāo)志物，聯(lián)合其他趨化因子可增強(qiáng)預(yù)測的特異性和敏感性[18]。本研究結(jié)果與前期文獻(xiàn)報(bào)道[22-24]的結(jié)果一致，證明研究結(jié)果的可靠性。

CDA是嘧啶挽救途徑中的一種酶，可參與游離嘧啶的循環(huán)利用來維持細(xì)胞嘧啶池的穩(wěn)定[25]，研究發(fā)現(xiàn)CDA在大約60%的癌細(xì)胞和組織(包括子宮頸癌)中表達(dá)下調(diào)[26]，本研究與上述研究結(jié)果一致。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞(包括HeLa細(xì)胞)中CDA缺乏可導(dǎo)致DNA損傷和細(xì)胞遺傳不穩(wěn)定，此過程與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[27-29]。結(jié)合現(xiàn)有研究，推測CDA的表達(dá)失調(diào)可能調(diào)控宮頸上皮內(nèi)病變甚至惡變，但其分子機(jī)制還需進(jìn)一步驗(yàn)證。LTF是一種鐵結(jié)合糖蛋白，可參與體內(nèi)鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、調(diào)節(jié)機(jī)制免疫，具有抗炎、抗微生物以及抗腫瘤等生物學(xué)活性[30-31]。有研究發(fā)現(xiàn)，LTF在人乳頭瘤病毒感染的早期發(fā)揮抑制作用[32]，在炎癥、惡變前表達(dá)上調(diào)，但在惡變后以及癌癥中表達(dá)下調(diào)[33]；另有研究發(fā)現(xiàn)來源于中性粒細(xì)胞的LTF可以促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子和趨化因子(白細(xì)胞介素-6、CC趨化因子配體20等)的表達(dá)[34]。LTF可能通過炎癥通路參與HSIL的發(fā)生發(fā)展。CRCT1由表皮分化復(fù)合物編碼，在食管鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)下調(diào)，CRCT1過表達(dá)可促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡并上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)[35]。目前LTF、CRCT與HSIL發(fā)生發(fā)展有直接關(guān)聯(lián)的相關(guān)研究較少，因此仍需要進(jìn)行深入研究。本研究的信號通路功能富集分析結(jié)果顯示，篩選出來的差異性表達(dá)基因主要富集在炎癥和癌癥相關(guān)的信號通路上，其中補(bǔ)體和凝血級聯(lián)、花生四烯酸代謝途徑是最顯著富集的3個(gè)炎癥相關(guān)通路。其中花生四烯酸代謝途徑主要用于炎癥介質(zhì)的合成，可介導(dǎo)各種炎癥細(xì)胞因子(如單核細(xì)胞趨化蛋白1、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素和干擾素)的產(chǎn)生與發(fā)展[36]。GO功能富集分析顯示，這些基因主要參與中性粒細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞分化、免疫等生物學(xué)過程，目前公認(rèn)的慢性中性粒細(xì)胞炎癥涉及許多類型的上皮癌的起始階段，可誘發(fā)惡變。越來越多的證據(jù)顯示，炎癥與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[37-38]，表明本研究鑒定的關(guān)鍵基因可能與HSIL的惡性進(jìn)展有關(guān)，尤其是這些炎癥細(xì)胞因子可能參與癌癥發(fā)展的后期階段，特別是轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散。

近年來，生物信息學(xué)已廣泛用于疾病相關(guān)的新標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)的挖掘。相較于其他HSIL研究中使用單一芯片的方式[7]，本研究采用RRA進(jìn)行了多芯片聯(lián)合分析，增大了樣本量，不僅合理地處理了4套芯片分析中實(shí)驗(yàn)平臺不同的問題，還根據(jù)不相關(guān)輸入的零假設(shè)來識別基因，對結(jié)果誤差和背景信號噪聲具有較好的魯棒性，進(jìn)而使得本研究獲得的疾病相關(guān)的基因更加可靠，這為HSIL的發(fā)展機(jī)制研究提供了新思路。

綜上所述，本研究鑒定了5個(gè)(CDA、LTF、CRCT1、CDKN2A、CXCL1)與HSIL相關(guān)的核心基因，可能為HSIL的篩查、診斷和預(yù)后提供可靠的分子生物標(biāo)志物。其中LTF、CRCT1兩個(gè)核心基因是首次提出可能成為新的HSIL生物標(biāo)志物，聯(lián)合已有的生物標(biāo)志物可能有助于早期篩查診斷和預(yù)后監(jiān)測。但本研究也存在一些不足，如篩選的4個(gè)芯片中，GSE63514和GSE7803樣本來自美國，GSE138080數(shù)據(jù)樣本來自荷蘭，GSE27678數(shù)據(jù)樣本來自英國，原始文獻(xiàn)并未給出樣本來源的具體種族?？紤]到不同種群之間存在遺傳背景的差異，故本研究在推廣應(yīng)用于其他人群可能會有一定限制，需要收集更多人群樣本進(jìn)行驗(yàn)證。