鄔旭龍 ，林 華 ，肖 璐 ，王 印

（1.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，四川 成都 611130；2.成都海關(guān)技術(shù)中心，四川 成都 610041；3.四川省畜牧科學(xué)研究院 動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川 成都 610066；4.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130）

中國是養(yǎng)豬大國，我國生豬產(chǎn)業(yè)正向?qū)I(yè)化和規(guī)?；缆钒l(fā)展，即由當初農(nóng)戶散養(yǎng)為主體的市場格局轉(zhuǎn)變成當前的多種養(yǎng)殖規(guī)模并存的格局。在經(jīng)歷了自然淘汰、市場選擇和養(yǎng)殖重整后，尤其是近兩年受環(huán)境治理拆遷、非洲豬瘟疫情和國家生豬布局優(yōu)化調(diào)整的影響，傳統(tǒng)的散養(yǎng)模式正加速向規(guī)?；椭悄芑曫B(yǎng)轉(zhuǎn)變[1]，散養(yǎng)和小規(guī)模養(yǎng)殖不斷退出，數(shù)量減少，大型規(guī)模化豬場逐漸成為中國養(yǎng)豬業(yè)重要的新生力量，在未來的發(fā)展中，規(guī)?；妥詣踊酿B(yǎng)豬模式必定成為國內(nèi)養(yǎng)豬生產(chǎn)的發(fā)展趨勢。盡管我國養(yǎng)殖模式轉(zhuǎn)型升級進程明顯加快，但微型和小型養(yǎng)豬場在少數(shù)地區(qū)仍然存在，這些豬場大多飼養(yǎng)條件差，養(yǎng)殖水平低，防疫、消毒、隔離等措施不到位，甚至飼喂泔水，因此導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生。某些規(guī)?；i場在養(yǎng)殖過程中，因其飼養(yǎng)管理和疫病防控能力差，同樣存在多種疾病混合感染的情況，使豬場對疾病的預(yù)防和控制越來越困難。加之豬場在引種、購買和養(yǎng)殖等過程中，生豬及其產(chǎn)品長距離調(diào)運，增大了各種病原體的傳播及生豬疾病感染和發(fā)病的空間跨度，加劇了各種病原體在豬場間的傳播，嚴重影響豬群健康水平和生物安全體系，豬場對疾病的有效防控能力降低，從而進一步加大了豬場對新發(fā)和外來動物疫病感染的可能性[2-5]。由于一些新發(fā)疫病病毒的復(fù)制能力強、突變速率高、并且具有重配和重組的變異方式[6-7]，這些疾病不僅嚴重威脅我國生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟和生態(tài)安全，同時給人類和動物的健康以及社會穩(wěn)定帶來巨大威脅。

近年來通過流行病學(xué)的調(diào)查和實驗室監(jiān)測數(shù)據(jù)分析，我國豬場疾病流行現(xiàn)狀為：豬病毒性疫病感染增多逐漸成為豬傳染病的主體；傳染性疾病的種類變多并有逐年增多的趨勢；多種病毒性疾病的混合感染越來越嚴重；非典型性病例的數(shù)量不斷增多，疾病的臨床癥狀和流行特點相似，給病原確診帶來了很大的困難。在面臨大量樣品的多種疾病鑒別診斷時，單病原診斷技術(shù)在未來的發(fā)展中已經(jīng)很難滿足臨床檢測的需要，而準確快速鑒別診斷病原對于制定治療和用藥方案、控制傳染病的流行具有重要意義。因此，更加高效率、自動化、高通量的檢測方法，可同時檢測多種豬病原體，為快速診斷和大批量樣品檢測提供新平臺。該研究通過高通量檢測方法對豬場病毒性疾病進行流行病學(xué)調(diào)查，通過檢測豬場病原的感染情況，從而反映和分析豬場對疾病的有效防控能力，可進一步為豬場對新發(fā)或外來動物疫病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 毒株

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）、日本乙型腦炎病毒（JEV）、口蹄疫病毒（FMDV）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬細小病毒（PPV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）陽性毒株來源于商品化疫苗，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物檢驗檢疫實驗室保存。

1.2 主要儀器

梯度PCR儀購于美國Bio-Rad公司；QIAxcel Advanced全自動核酸毛細管電泳儀購于德國QIAGEN公司；臺式冷凍離心機、-80 ℃超低溫冰箱、恒溫培養(yǎng)箱、NanoDrop 2000超微量分光光度計均購于Thermo Scientifi c。

1.3 主要試劑

2×Taq PCR Mastermix、 病毒核酸提取試劑盒、DL2000 DNA Marker，購自天根生化科技（北京）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自TaKaRa；瓊脂糖、GoldView染料，購自北京索萊寶科技有限公司，Multiplex PCR Kit，購自德國QIAGEN公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 臨床樣品

采集近年來四川不同地區(qū)25個養(yǎng)豬場臨床樣品共計426份，其中包括6個微型養(yǎng)豬場臨床樣品61份，8個中小型養(yǎng)豬場臨床樣品118份，11個規(guī)?；B(yǎng)豬場臨床樣品247份。臨床樣品包括脾臟、淋巴結(jié)、腎臟、肺臟等組織器官，精液、血液和糞便。具體樣品信息見表1。

表1 臨床樣品信息 個

1.5 病原檢測方法

利用高通量檢測方法[8]毛細管電泳全自動核酸分析系統(tǒng)對不同養(yǎng)豬場采集的臨床樣品進行檢測。其中內(nèi)臟組織器官在混合剪樣研磨后提取其核酸進行檢測，以滿足不同病原在各器官中的分布和含量不同的檢測需要。而精液和血液樣品中可能無法檢測到腹瀉病毒，因此需對同批采集的豬的糞便或肛門拭子同時檢測，從而保障檢測結(jié)果的準確性。

1.6 豬場疾病有效防控能力分析

對不同養(yǎng)豬場重要豬病毒性疫病進行分子流行病學(xué)調(diào)查，通過臨床樣品的陽性檢出率及混合感染情況進行統(tǒng)計，根據(jù)檢測結(jié)果，從病原感染角度分析微型養(yǎng)豬場、中小型養(yǎng)豬場和規(guī)模化養(yǎng)豬場，三種不同規(guī)模豬場對疾病的有效防控能力，而進一步推測豬場對新發(fā)和外來動物疫病，例如PRRSV NADC30-like、ASFV（非 洲 豬 瘟病毒）和PCV3（豬圓環(huán)病毒3型）等疫病的防控能力和感染易感性，為不同豬場針對新發(fā)和外來動物疫病病原監(jiān)測提供參考。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同豬場病原檢測結(jié)果

利用高通量檢測方法對不同養(yǎng)豬場采集的臨床樣品，進行9種豬重要病毒病原PRV、CSFV、FMDV、JEV、PCV2、PRRSV、PEDV、TGEV和PPV檢測，根據(jù)結(jié)果可知（表2），426份臨床樣品中，至少檢測到一種病原感染的陽性樣品數(shù)為234份，陽性檢出率為54.93%（234/426），表明四川養(yǎng)豬場感染病毒性病原情況已較為嚴重。對3種不同規(guī)模類型養(yǎng)豬場進行病原分子流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，微型養(yǎng)豬場的病原陽性檢出率最高，達到80%以上，中小型養(yǎng)豬場病原陽性檢出率為58.47%，規(guī)模化養(yǎng)豬場的病原陽性檢出率最低，為46.96%。在對不同樣品檢測中，組織器官的病原陽性檢出率較高，均在70%以上，其次為血液和糞便的混合樣品，而精液的陽性檢出率最低。分析原因可能是因為組織樣品和流產(chǎn)胎均采集于已死亡或者發(fā)病的豬群，而其他樣品包括血液和精液均采集于正常飼養(yǎng)的豬，其具有較高的飼養(yǎng)管理水平，因此陽性檢出率較低。

表2 不同規(guī)模豬場病原檢測結(jié)果

2.2 不同豬場病原感染情況分析

三種類型養(yǎng)豬場的病原檢測結(jié)果顯示（表3），豬場均普遍存在多種病原混合感染的情況，且較為嚴重，特別是微型養(yǎng)豬場，多重病原混合感染的陽性檢出率達到60%以上，遠遠高于單一病原的陽性檢出率，3種及以上不同病原的感染也較其他兩種豬場更為嚴重。多病原的混合感染以PCV2、PRRSV、PEDV、PRV最為常見，導(dǎo)致免疫抑制性疾病感染嚴重，使得豬群抵抗力和免疫力降低，為病原體的侵入和感染提供了條件，因此加大了其他傳染病感染和傳播的風險。

表3 不同豬場病原感染情況

2.3 豬場疾病有效防控能力分析

根據(jù)檢測結(jié)果統(tǒng)計豬場病原陽性檢出率和多病原混合感染情況，綜合分析來看，無論是病原的陽性檢出率，還是單一病原或多病原的混合感染復(fù)雜程度，都呈現(xiàn)微型養(yǎng)豬場＞中小型養(yǎng)豬場＞規(guī)?；B(yǎng)豬場的趨勢，表明微型養(yǎng)豬場病原感染情況最為嚴重，對疾病的防控效果也最差。中小型養(yǎng)豬場和規(guī)?；B(yǎng)豬場雖各項陽性檢出率有所下降，特別是多重病原混合感染有明顯降低，但病原的陽性檢出率仍較高，疾病防控形勢仍然不容樂觀，特別是PCV2和PRRSV免疫抑制類疫病的檢出率仍非常嚴重，使得豬場在面對新發(fā)和外來動物疫病PRRSV NADC30-like和ASFV傳播時，具有極高的感染風險。因此推測豬場對PRRSV NADC30-like和ASFV等外來與新發(fā)疫病的感染風險呈現(xiàn)微型養(yǎng)豬場＞中小型養(yǎng)豬場＞規(guī)模化養(yǎng)豬場的趨勢。

3 討論

隨著我國養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)化程度逐年提高，并呈加速增長趨勢，近年來在政策和行業(yè)發(fā)展要求之下，我國生豬養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)?；l(fā)展已經(jīng)進入了快速發(fā)展期，特別是在非洲豬瘟疫情和生豬復(fù)養(yǎng)發(fā)展的影響下，更加加速了我國生豬產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級的步伐[9]，生豬生產(chǎn)方式加快轉(zhuǎn)變，養(yǎng)殖綠色化、規(guī)?；瘍?yōu)勢明顯，規(guī)?；曫B(yǎng)模式將會代替?zhèn)鹘y(tǒng)的散養(yǎng)模式，具有非常好的發(fā)展前景。但在養(yǎng)殖過程中，仍然存在較多問題，許多養(yǎng)殖場生物安全和飼養(yǎng)管理措施不全，導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生。因此該研究在進行豬場疾病分子流行病學(xué)調(diào)查的過程中，主要考慮從三種不同飼養(yǎng)管理和規(guī)模類型的豬場進行臨床樣品的采集，利用建立的高通量檢測方法對其進行檢測，能較全面了解四川省豬場疾病感染情況，為病原流行病學(xué)調(diào)查及疾病防控提供參考。

疾病的暴發(fā)和流行不僅對豬場造成嚴重經(jīng)濟損失，同時也是制約我國養(yǎng)豬業(yè)持續(xù)發(fā)展的主要因素。近年來，豬場傳染病流行主要以病毒性疫病為主，因此該研究主要針對豬場常見的病毒性疾病進行分子流行病學(xué)調(diào)查，利用高效的高通量方法進行檢測，在面臨較大數(shù)量樣品的多項目檢測過程中具有明顯的優(yōu)勢，從結(jié)果分析可以看出，無論是病原的總陽性檢出率，還是多病原的混合感染情況，都呈現(xiàn)微型養(yǎng)豬場最高、中小型養(yǎng)豬場次之，規(guī)?；B(yǎng)豬場最低的趨勢，表明微型養(yǎng)豬場疾病感染情況最為嚴重，病原的陽性檢出率高達80%，表明微型養(yǎng)豬場在飼養(yǎng)環(huán)境、飼養(yǎng)管理和疫病防控等各方面的現(xiàn)狀，更容易造成疾病的發(fā)生和傳播。在病原感染中，混合感染情況非常嚴重，并且呈有增無減的流行趨勢，不但病原種類增多，而且流行具有普遍性，成為豬場疾病感染的主流。病原以PCV2、PRRSV、PEDV的感染最為常見，特別是PCV2和PRRSV的感染，已經(jīng)成為目前豬病中最為多發(fā)的病毒性疾病。

研究根據(jù)對不同豬場病原檢測結(jié)果，初步分析了豬場對疾病的有效防控能力，進而反映了在新發(fā)或外來動物疫病發(fā)生和傳播時，不同豬場的易感染性，推測其對新發(fā)和外來動物疫病發(fā)生的風險，可早期發(fā)現(xiàn)隱患，及時有針對性地采取策略和措施，有效提高防控效率和質(zhì)量，遏制疫病流行傳播，保障養(yǎng)豬業(yè)持續(xù)健康發(fā)展。該分析和推測是完全基于樣品病原檢出結(jié)果，而其余影響疾病發(fā)生的因素例如豬場飼養(yǎng)管理水平，免疫效果評價，外界環(huán)境變化等，這些防控措施的實施，最終都在疾病感染或病原陽性檢出率的結(jié)果中體現(xiàn)，無論豬場管理和防控措施做得再好，病原的監(jiān)測和臨床檢測結(jié)果最能表明豬場對疾病的有效防控綜合能力，從而為預(yù)防新發(fā)疫病的感染提供參考。另一方面，病原體是動物疫病傳播流行的根本，其他所有因素也是通過對生物學(xué)因素的作用而影響動物疫病的流行傳播[10]。通過分析結(jié)果可知，微型養(yǎng)豬場病原陽性檢出率最高，且多病原混合感染最為嚴重，表明微型養(yǎng)豬場對疾病的防控能力最差，推測其在新發(fā)或外來動物疫病的防控中面臨嚴峻形勢和挑戰(zhàn)。