阮宏椿，石妞妞，杜宜新，陳福如

（福建省作物有害生物監(jiān)測與治理重點(diǎn)實驗室/福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，福州 350013）

由稻瘟病菌Magnaportheoryzae引起的稻瘟病（rice blast）是一種重要的水稻真菌病害，可引起水稻大幅減產(chǎn)，甚至顆粒無收。據(jù)統(tǒng)計，每年由稻瘟病引起的水稻減產(chǎn)可達(dá)10%～30%，損失的稻米足以養(yǎng)活超過6000萬人[1]。目前，防治稻瘟病的主要措施包括選育種植抗病品種和化學(xué)藥劑防治，而抗病品種由于病原菌群體的遺傳變異速度較快而喪失抗性，化學(xué)藥劑防治具有防效高、成本低、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，是防治稻瘟病的有效方法，但也存在病原菌抗藥性、農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等問題[2-4]。因此，利用生物或其代謝產(chǎn)物防治稻瘟病具有環(huán)境友好、殘留低、不易使病原菌產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)[5,6]。隨著人們生活水平逐步提高，環(huán)境保護(hù)意識逐漸增強(qiáng)，生物防治已成為植物病害防治研究的一個重要方向。

近年來，生防菌及其代謝產(chǎn)物防治稻瘟病研究取得了一定的進(jìn)展。常用于水稻稻瘟病生防的微生物主要有真菌、細(xì)菌（放線菌）[7]。放線菌中產(chǎn)色鏈霉菌Streptomycesgriseochromogenes產(chǎn)生的滅瘟素?S[8]、春日鏈霉菌S.kasugaensis產(chǎn)生的春雷霉素[9]已用于稻瘟病防治。另有研究表明，婁徹氏鏈霉菌S.rochei[10]、灰色鏈霉菌S.griseus[11]、吸水鏈霉菌S.hygroscopicus[12]對稻瘟病菌也有較好的抑制作用。王棟等[13]從云南分離到的抗菌高麗菌Kribbellaantibioticasp.nov.對灰霉病、稻紋枯病、稻瘟病具有較強(qiáng)防治作用。鏈霉菌UPMRS4對稻瘟病菌菌絲生長抑制率達(dá)98.32%，孢子懸浮液浸種可降低67.9%的發(fā)病率[14]。涂鏈霉菌OsiSH?2對稻瘟病菌菌絲生長抑制率達(dá)75.3%，孢子懸浮液噴灑葉片可將自然發(fā)病的稻瘟病發(fā)病程度降低59.64%[15]。放線菌是極具代謝多樣性的微生物，世界上已發(fā)現(xiàn)的抗生素約有2/3是由放線菌產(chǎn)生的[16]。隨著分離方法的不斷改進(jìn)，那些傳統(tǒng)分離方法難以分離到的稀有放線菌被開發(fā)利用，近年來從稀有放線菌中的游動放線菌屬Actinoplanes、小雙孢菌屬M(fèi)icrobispora、擬無枝菌酸菌屬Amycolatopsis、糖多孢菌屬Saccharopolyspora發(fā)現(xiàn)了多種抗生素[17]。研究表明，藥用植物根際的微生物，長期受藥用植物根系分泌物質(zhì)的影響，其產(chǎn)生生物活性物質(zhì)的比例也顯著高于其他植物根際土壤微生物[18]。南方紅豆杉Taxuschinensisvar.mairei是一種非常重要的藥用植物資源，含有抗癌物質(zhì)紫杉醇[19]。張盼盼等[20]從紅豆杉植株和根際土壤中分離到111株放線菌，其中33株具有抑菌活性。因此，從紅豆杉根際土壤分離的稀有放線菌中篩選出對水稻稻瘟病有良好抑菌效果的拮抗菌株，對開展水稻稻瘟病生物防治具有重要的意義。

本研究以水稻稻瘟病菌為靶標(biāo)菌，從紅豆杉根際土壤中分離篩選稀有放線菌菌株，通過形態(tài)特征觀察、生理生化測定和16S rRNA、recA、gyrB和rpoB基因序列分析進(jìn)行菌株鑒定，并進(jìn)行防效測定。研究結(jié)果可為水稻稻瘟病的生物防治提供新的生防資源，為進(jìn)一步在生產(chǎn)上應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

土壤樣本：江西井岡山（北緯26°74′80″，東經(jīng)114°28′92″）紅豆杉根際周圍，去除表面的土壤，采集5～20 cm深處的土壤樣品，自然風(fēng)干后，于4 ℃冰箱保存。

靶標(biāo)病原真菌：水稻稻瘟病菌M.oryzae、大豆炭疽病菌Colletotrichumtruncatum、蘆筍莖枯病菌Phomopsisasparagi、水稻稻曲病菌Ustilaginoideavirens、蘑菇褐腐病菌Mycogoneperniciosa由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所分離、鑒定并保存。

供試水稻品種：廣陸矮4號、甬優(yōu)9號。

供試藥劑：75%三環(huán)唑可濕性粉劑，由江蘇豐登作物保護(hù)股份有限公司生產(chǎn)。

培養(yǎng)基：放線菌分離培養(yǎng)基為改良的HVA培養(yǎng)基[21]（淀粉2 g，KNO30.5 g，KCl 1.7g，MgSO4·7H2O 0.5 g，Na2HPO40.5 g，CaCO30.02 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，硫胺素0.5 mg，煙酸0.5 mg，泛酸0.5 mg，對?氨基苯甲酸0.5 mg，核黃素0.5 mg，維生素B6 0.5 mg，肌醇0.5 mg，生物素0.25 mg，瓊脂18 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.2，加入終濃度為100 ppm的重鉻酸鉀）；靶標(biāo)病原真菌培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基；放線菌鑒定培養(yǎng)基為察氏培養(yǎng)基、葡萄糖天冬素培養(yǎng)基、甘油天冬素培養(yǎng)基、無機(jī)鹽淀粉培養(yǎng)基、ISP?2培養(yǎng)基、燕麥粉培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基、桑塔氏培養(yǎng)基、明膠液化培養(yǎng)基、牛奶的凝固與胨化培養(yǎng)基、淀粉水解瓊脂培養(yǎng)基、硝酸鹽還原培養(yǎng)基，碳、氮源利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基[22]。

1.2 放線菌的分離純化

采用平板稀釋法分離土壤中的放線菌[23]。將土樣用研缽磨碎，稱取樣品1 g懸浮于9 mL無菌水中，于搖床中40 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)30 min后靜置5 min，依次稀釋10倍，分別配制成10?2、10?3、10?4的懸浮液，分別吸取不同濃度的懸浮液各0.1 mL加入到改良的HVA培養(yǎng)基（加入終濃度為100 ppm的重鉻酸鉀）平板上，均勻涂布后倒置于培養(yǎng)箱中，28 ℃培養(yǎng)，5 d后挑取不同的單菌落劃線純化，純化后的菌株采用甘油法保藏于?80 ℃冰箱。

1.3 拮抗放線菌的篩選

以水稻稻瘟病菌為靶標(biāo)菌，采用平板對峙法[24]，對分離到的放線菌進(jìn)行初篩。將放線菌在PDA培養(yǎng)基靠邊緣兩側(cè)劃線接種，3 d后在平板中央接入直徑5 mm的水稻稻瘟病菌菌餅，以不接放線菌為空白對照，3次重復(fù)，28 ℃倒置培養(yǎng)，7 d后測量菌落直徑和抑菌帶寬度。選擇抑菌帶寬，抑菌活性強(qiáng)且長勢旺的菌株進(jìn)行抑菌譜測定。

1.4 拮抗放線菌ST7-2抑菌譜

拮抗放線菌ST7?2接入ISP2液體培養(yǎng)基中，裝液量為80 mL/250 mL三角瓶，接種量5%，置于25 ℃、180 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)7 d得發(fā)酵液，于4 ℃、10000 r/min冷凍離心機(jī)中離心10 min，取上清用22 μm微孔濾膜過濾得無菌發(fā)酵濾液，備用。參考姚錦愛等[25]方法，測定拮抗放線菌ST7?2對水稻稻瘟病菌、水稻稻曲病菌、蘆筍莖枯病菌、大豆炭疽病菌、蘑菇褐腐病菌的抑制效果。將無菌發(fā)酵濾液10 mL加入到90 mL的PDA培養(yǎng)基中，混合后倒入培養(yǎng)皿中，在平板中央接入直徑5 mm的病原菌菌餅。28 ℃培養(yǎng)7 d后，測量菌落生長直徑，以PDA培養(yǎng)基為對照，重復(fù)3次，計算拮抗放線菌ST7?2無菌發(fā)酵濾液對病原菌菌絲生長的抑制率。抑制率（%）＝（對照菌落直徑－處理菌落直徑）/（對照菌落直徑－菌餅直徑）×100。

1.5 拮抗放線菌ST7-2的鑒定

1.5.1 拮抗放線菌ST7?2形態(tài)學(xué)觀察 采用插片法[26]，將拮抗放線菌ST7?2劃線接種于察氏培養(yǎng)基、葡萄糖天冬素培養(yǎng)基、甘油天冬素培養(yǎng)基、無機(jī)鹽淀粉培養(yǎng)基、ISP?2培養(yǎng)基、燕麥粉培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基、桑塔氏培養(yǎng)基上，置于28 ℃下培養(yǎng)，7 d后觀察有無基內(nèi)菌絲及菌絲顏色，可溶性色素，菌落生長情況，觀察有無氣生菌絲及菌絲形態(tài)。

1.5.2 拮抗放線菌ST7?2生理生化特征 參照《鏈霉菌鑒定手冊》[23]的方法，測定拮抗放線菌ST7?2明膠液化、牛奶的凝固與胨化、淀粉水解、硝酸鹽還原及碳、氮源的利用等生理生化特征。

1.5.3 拮抗放線菌ST7?2的分子鑒定 用細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取拮抗放線菌ST7?2的DNA。擴(kuò)增16S rRNA、recA基因[27]、gyrB基因[28]和rpoB基因[29]，與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行Blast比對，利用MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.6 拮抗放線菌ST7-2對水稻稻瘟病的防效

1.6.1 室內(nèi)防效測定 以水稻稻瘟病菌為靶標(biāo)菌，開展室內(nèi)苗期防效測定，參照杜宜新等[30]方法。將廣陸矮4號水稻種子播種于25 cm×50 cm育秧盤內(nèi)，稻瘟病菌分生孢子配制成1×105孢子/mL的懸浮液，備用。試驗設(shè)接種水稻稻瘟病菌+無菌水、接種水稻稻瘟病菌+拮抗放線菌ST7?2發(fā)酵液、接種水稻稻瘟病菌+拮抗放線菌ST7?2發(fā)酵液10倍稀釋液、接種水稻稻瘟病菌+75%三環(huán)唑WP1700倍液4個處理，每處理1盤，3次重復(fù)；水稻3葉1心期，噴霧接種水稻稻瘟病菌，每處理10 mL，2 h后再進(jìn)行分組均勻噴施，處理1噴無菌水50 mL，處理2噴拮抗放線菌ST7?2發(fā)酵液50 mL，處理3噴拮抗放線菌ST7?2發(fā)酵液10倍稀釋液50 mL，處理4噴75%三環(huán)唑WP 1700倍液50 mL，用塑料膜遮蓋保濕，并用遮光布覆蓋，24 h后去除遮光布和塑料膜，在25 ℃～28 ℃溫室內(nèi)保濕6 d，參照石妞妞等[31]的標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查發(fā)病情況，每處理調(diào)查50株，計算病情指數(shù)和防治效果。

1.6.2 田間防效測定 在福建省南平市建陽區(qū)水稻種植基地（東經(jīng) 117°90′14″，北緯 27°36′50″），常年稻瘟病重病田塊，水稻品種為甬優(yōu)9號。試驗設(shè)無菌水、拮抗放線菌ST7?2發(fā)酵液、拮抗放線菌ST7?2發(fā)酵液10倍稀釋液、75%三環(huán)唑WP1700倍液、4個處理，3次重復(fù)，共計12個小區(qū)，隨機(jī)排列，每小區(qū)30 m2，每小區(qū)用藥量2000 mL。于水稻破口期開始噴霧處理，7 d后，各小區(qū)均重復(fù)噴施1次；于水稻蠟熟期，采用5點(diǎn)取樣法，每個小區(qū)調(diào)查50穗，參照GB/T 17980.19—2000《農(nóng)藥田間藥效試驗準(zhǔn)則（一）》[32]調(diào)查穗瘟的病情，并計算病情指數(shù)和防治效果。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Excel 2007、SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用LSD多重比較法進(jìn)行差異性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 放線菌分離和拮抗菌篩選

從供試土壤樣品中分離獲得11株具有抗菌活性的放線菌，ST2?6、ST7?2和ST8?4 3株放線菌對水稻稻瘟病菌抑菌帶寬度大于10 mm（表1），其中菌株ST7?2抑菌帶寬度為17.33 mm，且長勢旺，因此，本研究選擇ST7?2進(jìn)行下一步試驗（圖1）。

表1 11株放線菌對水稻稻瘟病菌的抑菌效果Table 1 The inhibition effect of 11 actinomyces strains on M.oryzae

圖1 菌株ST7-2 對水稻稻瘟病菌的平板對峙效果Fig.1 Dual culture plates of control and inhibition of M.oryzae by strain ST7-2

2.2 拮抗放線菌ST7-2的抑菌譜

抑菌譜測定結(jié)果表明（表2，圖2），菌株ST7?2 無菌發(fā)酵濾液對供試的5種植物病原真菌都有不同程度的抑制作用，其中對水稻稻曲病菌抑制作用最強(qiáng)，抑制率為76.82%，對蘆筍莖枯病菌和水稻稻瘟病菌菌也具有較強(qiáng)的抑制作用，抑制率分別為60.60%和48.11%，對蘑菇褐腐病菌和大豆炭疽病菌的抑制率分別為15.13%和14.94%。

圖2 菌株ST7-2無菌發(fā)酵濾液對植物病原菌的平板抑制效果Fig.2 Inhibition of mycelia growth of 5 fungal pathogens by sterile fermentation filtrate of strain ST7-2

表2 放線菌ST7-2無菌發(fā)酵濾液對5種病原菌的抑制作用Table 2 Inhibition of mycelia growth of 5 fungal pathogens by sterile fermentation filtrate of strain ST7-2

2.3 拮抗放線菌ST7-2鑒定

2.3.1 形態(tài)特征 ST7?2在高氏一號培養(yǎng)基中菌落灰白色，表面干燥，近圓形，氣生菌絲白灰色及乳黃色，基內(nèi)菌絲酪黃色，孢子絲直、柔曲、鉤狀、松敞及緊密螺旋形，孢子橢圓形，柱形，無可溶性色素產(chǎn)生（表3）；在高氏一號、無機(jī)鹽淀粉、ISP?2、燕麥粉、桑塔氏培養(yǎng)基上生長良好，在察氏、葡萄糖天冬素、甘油天冬素培養(yǎng)基上生長一般；除在察氏、葡萄糖天冬素培養(yǎng)基上無氣生菌絲，在其他培養(yǎng)基上均可產(chǎn)生氣生菌絲，氣生菌絲量在甘油天冬素培養(yǎng)基上產(chǎn)生較少，在其他培養(yǎng)基上生長茂盛，氣生菌絲在各培養(yǎng)基上顏色不一，多為不同深淺的白色或灰色；基內(nèi)菌絲的顏色也有多種，多為白色、黃色和綠色；在8種培養(yǎng)基中均無可溶性色素產(chǎn)生。

表3 菌株ST7-2在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征Table 3 Culture characters of strain ST7-2 on different media

2.3.2 生理生化特征 生理生化試驗結(jié)果（表4）表明，菌株ST7?2碳源能利用葡萄糖、甘露糖、甘露醇、乳糖、半乳糖、麥芽糖、蜜二糖、棉籽糖、海藻糖、果糖、核糖、糖原、苦杏仁苷、肌醇、甘油、葡萄糖酸鈉，不能利用山梨糖、山梨醇、蔗糖、松三糖、鼠李糖、木糖、菊糖、阿拉伯糖、水楊苷、赤蘚醇、蘋果酸鈉、馬尿酸鈉、琥珀酸鈉；氮源能利用L?脯氨酸，不能利用L?丙氨酸、L?賴氨酸、L?蘇氨酸；能凝固、胨化牛奶；硝酸鹽還原、明膠液化、酪氨基酸酶、淀粉酶試驗均為陰性。結(jié)合形態(tài)特征觀察，初步將菌株ST7?2鑒定為鏈霉菌屬Streptomycessp.。

表4 菌株ST7-2的生理生化特征Table 4 Physiological and biochemical characteristics of strain ST7-2

2.3.3 分子鑒定 菌株ST7?2的16S rRNA、recA、gyrB和rpoB基因擴(kuò)增片段長度分別為1364、806、906和785 bp，提交到Genbank獲得的登錄號分別為MW067371、MW071166、MW071167和MW071168。同源性比對（圖3）發(fā)現(xiàn)，菌株ST7?2的16S rRNA序列與利巴尼鏈霉菌S.libani、吸水鏈霉菌S.hygroscopicus、殺結(jié)節(jié)鏈霉菌S.tubercidicus、黑鏈霉菌S.nigrescens、狹霉素鏈霉菌S.angustmyceticus、扁平鏈霉菌S.platensis、暗黑漆鏈霉菌S.atrolaccus的相似性達(dá)99%以上；recA基因序列與殺結(jié)節(jié)鏈霉菌S.tubercidicus的相似性達(dá)99.60%；gyrB基因序列與殺結(jié)節(jié)鏈霉菌的相似性達(dá)100%；rpoB基因序列與殺結(jié)節(jié)鏈霉菌的相似性達(dá)99.44%；在recA、gyrB、rpoB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹上，與殺結(jié)節(jié)鏈霉菌聚為一簇。結(jié)合形態(tài)和生理生化特征，最終確定ST7?2為殺結(jié)節(jié)鏈霉菌。

圖3 基于16S rRNA (A)、recA (B)、gyrB (C)和rpoB (D)構(gòu)建菌株ST7-2的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain ST7-2 based on the sequence of 16S rRNA (A), recA (B), gyrB (C) and rpoB (D)

2.4 拮抗放線菌ST7-2的防治效果測定

2.4.1 室內(nèi)防效 室內(nèi)苗期防效測定結(jié)果表明，菌株ST7?2發(fā)酵液及其10倍稀釋液能有效降低水稻稻瘟病菌的病情指數(shù)，其防治效果分別為82.76%和62.94%。菌株ST7?2發(fā)酵液處理和75%三環(huán)唑WP 1700倍液處理組的防治效果分別為82.76%和81.01%，無顯著差異（表5，圖4）。

2.4.2 田間防效 清水對照處理的水稻穗瘟病情指數(shù)15.41，而菌株ST7?2發(fā)酵液和75%三環(huán)唑WP處理的穗瘟病情指數(shù)明顯減輕，病情指數(shù)為2.96～4.07；菌株ST7?2發(fā)酵液10倍液防治效果較低，僅為40.86%；菌株ST7?2發(fā)酵液處理防治效果為73.57%，低于75%三環(huán)唑WP 1700倍液的防治效果（表5，圖4）。

圖4 菌株ST7-2對水稻稻瘟病的室內(nèi)防治效果Fig.4 Control effects of strain ST7-2 on rice blast in the lib

表5 菌株ST7-2對水稻稻瘟病的防治效果Table 5 Control effects of strain ST7-2 on Rice blast

3 討論

迄今世界上已發(fā)現(xiàn)的抗生素約50%是由鏈霉菌產(chǎn)生的[33]，隨著對鏈霉菌的大量篩選，從鏈霉菌中獲得新的活性物質(zhì)的幾率大大降低，研究者提高并改進(jìn)分離方法，得到常規(guī)方法難分離到的稀有放線菌，從中發(fā)現(xiàn)了大量有價值的抗生素。本研究從土壤樣品中分離到11株稀有放線菌，通過篩選發(fā)現(xiàn)菌株ST7?2對水稻稻瘟病菌的抑菌效果最強(qiáng)，通過形態(tài)特征、生理生化特征觀察和16S rRNA、recA、gyrB與rpoB基因序列分析，確定該菌株為鏈霉菌屬的殺結(jié)節(jié)鏈霉菌。菌株ST7?2對水稻稻瘟病菌有較好的抑制效果，抑菌帶寬度達(dá)17.33 mm，其發(fā)酵液對水稻稻瘟病菌的室內(nèi)防效可達(dá)82.76%，與75%三環(huán)唑WP 1700倍液無顯著差異，田間試驗的防治效果達(dá)73.57%，略低于75%三環(huán)唑WP 1700倍液處理。菌株ST7?2對水稻稻瘟病菌絲生長的抑制率低于鏈霉菌UPMRS4和涂鏈霉菌OsiSH?2，但是對病害防治效果高于UPMRS4和 OsiSH?2[14,15]。

鏈霉菌的應(yīng)用于生物防治除了利用活體競爭作用、誘導(dǎo)或提高植物抗病性外，很重要的是利用其代謝產(chǎn)物防治病害。研究表明，殺結(jié)節(jié)鏈霉菌是一種稀有放線菌，其代謝產(chǎn)物殺結(jié)核菌素 tubercidin具有很強(qiáng)的生物活性[34]。殺結(jié)節(jié)鏈霉菌NBRC13090代謝產(chǎn)物tubercidin 對白色念珠菌，結(jié)核分枝桿菌和糞鏈球菌具有生物活性[34]。Ratti等[35]從Solanunlycocarpum中分離到一株殺結(jié)節(jié)鏈霉菌，經(jīng)測定其對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色念珠菌具有抗菌活性，其粗提物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有抗菌活性。菌株ST7?2粗提物對多種病原真菌都有抑菌活性，不僅對水稻稻瘟病菌和水稻稻曲病菌抑菌活性強(qiáng)，菌絲生長抑制率為48.11%和76.82%，而且對蘆筍莖枯病菌、蘑菇褐腐病菌和大豆炭疽病菌等也有較好的拮抗作用，菌絲生長抑制率分別為60.60%、15.13%和14.94%。

生防菌應(yīng)用于生產(chǎn)，土壤有機(jī)質(zhì)、溫度、濕度等外界環(huán)境的不穩(wěn)定性是拮抗菌面臨的一個重要問題，本研究中菌株ST7?2在室內(nèi)和田間試驗都表現(xiàn)出較好的防效，可替代三環(huán)唑等部分生產(chǎn)中防控稻瘟病的常用化學(xué)藥劑，生防應(yīng)用前景廣闊。本研究僅對ST7?2活菌及其粗提物防治稻瘟病進(jìn)行研究，后續(xù)將進(jìn)一步分析其代謝產(chǎn)物中的抑菌活性物質(zhì)，明確其抑菌機(jī)制，以期更好地利用拮抗菌株防控作物致病菌。