張榮勝，于俊杰，齊中強(qiáng)，張 浩，杜 艷，俞咪娜，宋天巧，曹慧娟，潘夏艷，雍明麗，陳志誼，劉永鋒

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，南京 210014）

稻曲病是由半知菌亞門稻綠核菌（Ustilaginoideaoryza，無(wú)性態(tài)）、子囊菌亞門稻麥角菌（Claviceps virens，有性態(tài)）侵染為害引起的，在世界上水稻的主要產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，是水稻生產(chǎn)中的一種重要真菌病害[1,2]。近年來(lái)隨著我國(guó)水稻品種更替和栽培方式的改變，稻曲病的發(fā)生呈現(xiàn)出加重的趨勢(shì)；稻曲病的發(fā)生和流行與氣候、品種、栽培及肥水管理密切相關(guān)，在不同年度間和地區(qū)間，以及品種間發(fā)生為害差異大；稻曲病在低溫高濕的環(huán)境下，發(fā)病尤為嚴(yán)重，一般可造成20%～30%的產(chǎn)量損失，嚴(yán)重時(shí)可減產(chǎn)50%以上[1-4]。稻曲病菌形成稻曲球過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生毒素，對(duì)稻米品質(zhì)產(chǎn)生嚴(yán)重影響[1,5-7]。目前生產(chǎn)上防治以化學(xué)農(nóng)藥為主，主要是三唑類殺菌劑，化學(xué)藥劑的過(guò)量使用易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致藥劑防效降低，同時(shí)造成稻谷上農(nóng)藥殘留超標(biāo)；長(zhǎng)期過(guò)量使用化學(xué)農(nóng)藥也對(duì)生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重污染。因此，利用有益微生物來(lái)防治水稻稻曲病具有廣闊的應(yīng)用前景[8,9]。

解淀粉芽胞桿菌是一類好氧、能夠產(chǎn)芽胞的革蘭氏陽(yáng)性桿狀細(xì)菌，廣泛分布在土壤、水體、植物表面、植物根際等生境的環(huán)境友好型微生物；芽胞桿菌能夠通過(guò)分泌抗菌物質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)和空間競(jìng)爭(zhēng)、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性等多種機(jī)制來(lái)防治植物病害[10-14]。尹小樂(lè)等[15]分離出2株對(duì)稻曲病菌菌絲具有強(qiáng)抑制作用的枯草芽胞桿菌SF-62和SF-3-38，田間試驗(yàn)結(jié)果顯示防效分別為47.9%和43.1%；李晶等[16]分離獲得1株短小芽胞桿菌ZHQN-6，對(duì)稻曲病菌菌絲生長(zhǎng)抑菌率和孢子萌發(fā)率分別為50.76%和74.85%；沙月霞等[17]發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽胞桿菌E69對(duì)稻瘟病具有顯著的預(yù)防效果；朱哲遠(yuǎn)等[18]研究發(fā)現(xiàn)1株蠟質(zhì)芽胞桿菌B-7對(duì)稻曲病菌抑菌活性為72%，田間防效為63.9%。江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院篩選獲得一株解淀粉芽胞桿菌B.amyloliquefaciensJt84對(duì)水稻稻曲病具有良好防效。本文針對(duì)生防菌Jt84在水稻葉表的定殖規(guī)律、防治水稻稻曲病最佳時(shí)期和田間使用量等方面開(kāi)展研究，以期為生防菌Jt84的高效應(yīng)用和開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試水稻品種：南粳9108。

供試菌株：解淀粉芽胞桿菌Jt84，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所水稻病害研究室提供。生防菌Jt84菌株用YPG培養(yǎng)基（胰蛋白胨5.0 g，葡萄糖5.0 g，酵母膏5.0 g，補(bǔ)水至1000 mL，pH 7.0，固體培養(yǎng)基（YPGA）在以上成分基礎(chǔ)上加入15.0～17.0 g瓊脂粉）培養(yǎng)。

供試藥劑：13%井岡霉素水劑，浙江省桐廬匯豐生物科技有限公司。

1.2 生防菌Jt84菌液制備

從保存菌株Jt84的試管中用接種環(huán)挑取一環(huán)在YPGA斜面上進(jìn)行活化，放置于培養(yǎng)箱中28 ℃～30 ℃培養(yǎng)24～48 h，得到新鮮活化的Jt84菌株；然后挑取一環(huán)轉(zhuǎn)接到Y(jié)PG培養(yǎng)液（330 mL/1000 mL三角瓶）中，在30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)48 h，獲得的發(fā)酵液中菌體含量為6.0×108cfu/mL。

發(fā)酵工藝流程：菌株Jt84斜面移殖活化（YPGA 培養(yǎng)基），28 ℃培養(yǎng)24 h；搖瓶擴(kuò)繁2000 mL YPG培養(yǎng)液，30 ℃、150 r/min 培養(yǎng)48 h；種子罐一級(jí)發(fā)酵2 t，34.0 ℃～35.0 ℃，培養(yǎng)8.5 h；大罐二級(jí)發(fā)酵10 t，36.0 ℃～39.0 ℃，培養(yǎng)18～20 h，發(fā)酵完成，此時(shí)菌體含量為1.0×1010cfu/mL；分裝后生防菌Jt84菌體含量為4.0×109cfu/mL。

1.3 菌株Jt84gfp在水稻葉片上的定殖動(dòng)態(tài)

感受態(tài)細(xì)胞制備方法參考文獻(xiàn)[19,20]作適當(dāng)修改，挑取Jt84單菌落接種于10 mL的GCHE培養(yǎng)基中，在37 ℃、200 r/min培養(yǎng)到OD600值約為0.5～0.8時(shí)，然后等量加入10 mL的GC培養(yǎng)基繼續(xù)共培養(yǎng)1 h；將上述菌體以8000 r/min離心10 min后收集，懸浮于含0.5%葡萄糖的1 mL培養(yǎng)液中，分裝保存即為感受態(tài)細(xì)胞。向0.2 mL感受態(tài)細(xì)胞中加入100 ng 標(biāo)記熒光基因的穿梭質(zhì)粒prp22-gfp，孵育20 min后加入YPG培養(yǎng)液，37 ℃、200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)90 min，最后將培養(yǎng)菌體涂布于含有氯霉素抗性的YPGA培養(yǎng)基上，挑選轉(zhuǎn)化子，獲得熒光標(biāo)記的菌株Jt84gfp。將篩選獲得的熒光標(biāo)記菌株接種于YPG培養(yǎng)液中，在30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)48 h，發(fā)酵后菌液于水稻三葉期噴施進(jìn)行后續(xù)定殖試驗(yàn)。分別于噴施后0、1、3、5、7、9、16、21和30 d采集水稻葉片（長(zhǎng)約5 cm葉段），用剪刀剪碎，放入試管，加入5 mL無(wú)菌水，30 ℃、200 r/min，振蕩培養(yǎng)1 h，然后稀釋為10-3、10-4、10-5和10-6，涂布在含5 μg/mL氯霉素的YPGA平板，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)；采集的葉片在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 生防菌Jt84不同噴施時(shí)期對(duì)水稻稻曲病的防效測(cè)定

生防菌第一次用藥時(shí)期分別為水稻“葉枕平（零葉枕距）”（劍葉葉枕與倒數(shù)第二葉葉枕處于同一水平）和“正葉枕距”（劍葉葉枕高于倒數(shù)第二葉葉枕3～5 cm）；第二次用藥時(shí)期為水稻破口期。第二次噴施生防菌30 d后根據(jù)稻穗為害癥狀程度分級(jí)，計(jì)算防治效果。

1.5 生防菌Jt84防治稻曲病田間示范試驗(yàn)

田間小區(qū)試驗(yàn)于2019年在江蘇省淮安區(qū)平橋鎮(zhèn)張國(guó)平家庭農(nóng)場(chǎng)中進(jìn)行，水稻品種為南粳9108。小區(qū)面積為20 m2，每處理4次重復(fù)，小區(qū)隨機(jī)排列。田間試驗(yàn)使用的Jt84發(fā)酵液由江蘇省蘇科農(nóng)化有限公司發(fā)酵制成，菌體含量為4.0×109cfu/mL，生防菌Jt84用量為200、300和400 mL/667 m2，兌水20 L均勻噴霧；13%井岡霉素水劑田間用量為50 mL/667 m2，兌水20 L均勻噴霧。在水稻破口前5～7 d施藥，間隔7～10 d左右進(jìn)行第二次防治。調(diào)查方法：參照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部藥檢所“NY/T 1464.54—2014農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則第54部分：殺菌劑防治水稻稻曲病”的規(guī)定進(jìn)行。每小區(qū)5點(diǎn)取樣，每點(diǎn)選取200穗。根據(jù)稻穗為害癥狀程度分級(jí)，記錄。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參考張正煒等[3]計(jì)算病情指數(shù)和防效，0級(jí)：無(wú)??；1級(jí)：每穗 1個(gè)稻曲球；3級(jí)：每穗2個(gè)稻曲球；5級(jí)：每穗3～5個(gè)稻曲球；7級(jí)：每穗6～9個(gè)稻曲球；9級(jí)：每穗10個(gè)及以上稻曲球。病情指數(shù)＝∑（各級(jí)發(fā)病數(shù)×各級(jí)代表值）/（調(diào)查總穗數(shù)×最高級(jí)代表值）×100；防治效果（%）＝[（對(duì)照區(qū)病情指數(shù)—處理區(qū)藥后病情指數(shù)）/對(duì)照區(qū)病情指數(shù)）]×100。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用DPS 7.05軟件Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 解淀粉芽胞桿菌Jt84在水稻葉面的定殖規(guī)律

將攜帶gfp基因的載體導(dǎo)入生防菌株Jt84中，篩選獲得發(fā)熒光的Jt84gfp菌株（圖1）。將生防菌噴施于三葉期的水稻葉片上，回收后涂布于抗氯霉素抗性平板進(jìn)行菌量檢測(cè)。結(jié)果表明，噴霧初始菌體含量為6×108cfu/mL芽胞桿菌發(fā)酵液，2 h在水稻葉面定殖菌量為4×106cfu/cm2，隨時(shí)間增加定殖生防菌數(shù)量緩慢降低；噴施后7～16 d檢測(cè)到生防菌的菌量保持相對(duì)穩(wěn)定，維持在104cfu/cm2；21 d后，檢測(cè)到的生防菌數(shù)量明顯降低，30 d時(shí)在葉片表面仍可檢測(cè)到少量菌體，定殖量為22 cfu/cm2（圖2）；將3和7 d采集的葉片進(jìn)行熒光顯微觀察，發(fā)現(xiàn)菌株Jt84gfp在水稻葉表大量存在（圖3），以上結(jié)果顯示生防菌Jt84在水稻葉片表面可以有效定殖。

圖1 熒光標(biāo)記解淀粉芽胞桿菌Jt84gfpFig.1 Fluorescent labeling of B.amyloliquefaciens Jt84gfp

圖2 熒光標(biāo)記菌株Jt84gfp 在水稻葉面定殖動(dòng)態(tài)Fig.2 Colonization dynamics of fluorescent-labeled Jt84gfp strain on rice leaves

圖3 菌株Jt84gfp在水稻葉片上定殖的熒光顯微觀察（A：3 d；B：7 d）Fig.3 Fluorescence microscopic observation on the colonization of Jt84gfp strain on rice leaves (A: 3 d; B:7 d)

2.2 生防菌Jt84對(duì)水稻稻曲病最佳防治時(shí)期測(cè)定

由表1看出，生防菌Jt84在水稻“零葉枕距”和“正葉枕距”時(shí)期用藥防治，盆栽試驗(yàn)結(jié)果顯示：生防菌對(duì)稻曲病的防治效果分別為85.3%和76.5%，表明生防菌Jt84防治稻曲病的初次用藥最佳防治時(shí)期為水稻葉枕平時(shí)期。

表1 生防菌Jt84不同防治時(shí)期對(duì)水稻稻曲病的防效測(cè)定Table 1 Determination of the control effect of strain Jt84 on rice false smut in different periods

2.3 生防菌Jt84對(duì)稻曲病的田間防治效果

解淀粉芽胞桿菌Jt84懸浮劑田間防治試驗(yàn)結(jié)果表明，解淀粉芽胞桿菌懸浮劑對(duì)水稻稻曲病具有良好的防治效果。解淀粉芽胞桿菌Jt84懸浮劑使用劑量為200～400 mL/667 m2時(shí)，田間防效為77.8%～89.5%；在生防菌Jt84用量為200 mL/667 m2時(shí)對(duì)水稻稻曲病的田間防效與13%井岡霉素水劑防效相當(dāng)（表2）。結(jié)果表明解淀粉芽胞桿菌Jt84懸浮劑對(duì)水稻稻曲病具有顯著防效，可以有效預(yù)防稻曲病菌對(duì)水稻的侵染。

表2 40億芽胞/毫升解淀粉芽胞桿菌Jt84懸浮劑田間試驗(yàn)效果（江蘇淮安）Table 2 Field trial effect of B.amyloliquefaciens Jt84 with 4.0×109 cfu/mL (Huai’an, Jiangsu Province)

3 討論

本試驗(yàn)對(duì)生防菌Jt84在水稻葉表的定殖規(guī)律和田間應(yīng)用技術(shù)進(jìn)行研究，目的在于挖掘生防菌Jt84的生防潛力。生防菌發(fā)揮作用的前提在于其能在植物的葉圍和根圍有效定殖，而芽胞桿菌在植物根圍或葉圍生存主要以生物膜的形式存在，生物膜能提高芽胞桿菌的生存競(jìng)爭(zhēng)力和抵御外界不良環(huán)境因素的影響，同時(shí)還能保證芽胞桿菌在植物根圍或葉圍的定殖種群數(shù)量，從而發(fā)揮有效的生防和促生作用[21,22]。Luisa等[23]研究表明枯草芽胞桿菌 EA-CB0575在香蕉和番茄根際都能夠有效定殖，表現(xiàn)出一定的促生作用，但它們?cè)诓煌参锔H分布模式存在不同；Priyanka等[24]獲得芽胞桿菌Bacillussp.MT7表現(xiàn)出良好的生物膜形成能力，同時(shí)它能夠在番茄根際大量定殖，顯著促進(jìn)植物生長(zhǎng)。前期研究也發(fā)現(xiàn)生防菌Jt84形成生物膜的褶皺較明顯，以及形成的生物膜較厚[25]；定殖規(guī)律結(jié)果顯示，生防菌Jt84在16 d內(nèi)數(shù)量維持在104cfu/cm2左右，表明其能在水稻葉表有效定殖，且在一定的時(shí)間范圍內(nèi)定殖量維持相對(duì)較高水平，是一株具有良好生防潛力的菌株。通過(guò)生防菌Jt84不同防治時(shí)期對(duì)稻曲病盆栽防治試驗(yàn)，結(jié)果顯示在“零葉枕距”時(shí)期用藥防治稻曲病防效顯著高于“正葉枕距”時(shí)期（表1），這點(diǎn)與黃世文[2]研究結(jié)果一致。有研究表明稻曲病的侵染時(shí)期發(fā)生在水稻孕穗期，此時(shí)期在田間也檢測(cè)到了稻曲病菌子囊孢子的存在[23]，我們推測(cè)生防菌在水稻葉枕平時(shí)期使用，通過(guò)在水稻葉表定殖，產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，有效抑制稻曲病菌孢子侵染水稻，延緩病害迅速蔓延。

研究表明芽胞桿菌可以產(chǎn)生對(duì)植物病原真菌具有抑菌活性的抗菌物質(zhì)，主要為低分子量的抗生素如脂肽類、聚酮類、細(xì)菌素以及高分子量蛋白類抗菌物質(zhì)等[11,13-14]；芽胞桿菌產(chǎn)生的脂肽類物質(zhì)能激活植株體內(nèi)防衛(wèi)反應(yīng)基因表達(dá)，誘導(dǎo)寄主植株產(chǎn)生ISR抵御病原菌入侵[26-28]。Farzand等[29]研究顯示解淀粉芽胞桿菌 EZ1509對(duì)核盤菌具有良好的抑菌活性，其中起主要抗真菌活性物質(zhì)是脂肽類抗生物。Rodríguez等[30]研究認(rèn)為surfactin能夠誘導(dǎo)花生產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性，抵御花生白絹病菌的侵染；Paiboon等[31]也發(fā)現(xiàn)fengycin和iturin A誘導(dǎo)柑橘植株中防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)PAL，ACS1，ACO，CHI和GLU的基因表達(dá)。前期研究也表明，生防菌Jt84能夠分泌3種脂肽類抗菌物質(zhì)（surfactin、iturin和fengycin），推測(cè)生防菌Jt84同樣誘導(dǎo)水稻產(chǎn)生ISR，對(duì)此還需進(jìn)一步研究。本文研究顯示，在田間應(yīng)用生防菌Jt84防治水稻稻曲病，最適噴施期應(yīng)在葉枕平時(shí)期，通過(guò)大量引入生防菌，利用生防菌占領(lǐng)侵染位點(diǎn)、分泌抗菌物質(zhì)抑制病原菌生長(zhǎng)繁殖等措施來(lái)減輕病原真菌對(duì)水稻的危害。田間試驗(yàn)也顯示生防菌Jt84能夠有效地防治水稻稻曲病，使用量在300～400 mL/667 m2時(shí)，防效顯著高于13%井岡霉素水劑。后續(xù)將在前期基礎(chǔ)上，對(duì)生防菌Jt84防治水稻稻曲病的防治機(jī)理進(jìn)行深入研究，為生防芽胞桿菌防治稻曲病的田間高效應(yīng)用提供理論依據(jù)。