鐘寶珠，呂朝軍，李朝緒，覃偉權(quán)

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所/海南省檳榔產(chǎn)業(yè)工程研究中心，文昌 571339）

昆蟲病原線蟲（entomopathogenic nematode，簡(jiǎn)稱 EPN）是昆蟲的一種專化寄生性天敵，包括斯氏線蟲科 Steioertidae 和異小桿線蟲科 Heterorhabditidae 等種類，具有殺蟲力強(qiáng)，殺蟲譜廣，生態(tài)安全等優(yōu)點(diǎn)，是一種重要的生物防治資源[1]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)應(yīng)用EPN代替化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行害蟲防治的研究已有所報(bào)道[2-4]。EPN除了對(duì)地下害蟲有特效[5-8]，還對(duì)亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis[9]、小木蠹蛾Holcocerusinsularis[10]、腰果云翅斑螟Nephopteryxsp.[11]等多種鱗翅目鉆蛀性害蟲也有較好的防控效果。

紅脈穗螟TirathabarufivenaWalker是檳榔上的重要害蟲，其為害隱蔽，主要以幼蟲蛀食花苞及幼嫩組織造成落花落果，同時(shí)危害檳榔心葉組織，造成心葉部位的“枯死性黃化”，嚴(yán)重影響產(chǎn)量。目前，國(guó)內(nèi)外利用EPN防治紅脈穗螟的報(bào)道較少。本研究從海南檳榔主要產(chǎn)區(qū)的檳榔園中進(jìn)行EPN的收集與分離，測(cè)定其對(duì)紅脈穗螟的致病力，以期為田間紅脈穗螟的生物防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 土樣采集和試驗(yàn)蟲源

土樣采集：在海南省文昌市、瓊海市、定安縣、屯昌縣、萬寧市、保亭縣、海口市、三亞市等檳榔主要產(chǎn)區(qū)的檳榔園中采集土樣。采樣時(shí)用挖刀刮掉土壤表層土，取濕潤(rùn)層土壤1000 g，裝入保鮮袋中，寫好標(biāo)簽標(biāo)明時(shí)間、地點(diǎn)等信息，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行線蟲分離。

試驗(yàn)蟲源：大蠟螟為本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)采用人工飼料（以蜂蜜、玉米粉及奶粉等為主要成分，并添加適量防霉劑）進(jìn)行自繁自育的種群；紅脈穗螟幼蟲采自海南省文昌市郊區(qū)檳榔園，帶回實(shí)驗(yàn)室內(nèi)以檳榔心葉進(jìn)行繼代培養(yǎng)4代以上，挑選健康的3齡幼蟲供試。

1.2 昆蟲病原線蟲分離

采用大蠟螟誘集法[12,13]。將采集的土樣進(jìn)行適當(dāng)晾曬，調(diào)整土樣含水量為8%～10%后，每份土樣平均分成3份（作為3次重復(fù)）裝入樣品杯中，每個(gè)杯中土樣量約為300 g，分別放入大蠟螟老熟幼蟲8頭。每天上、下午共2次上下顛倒樣品杯使土樣中的大蠟螟上下爬動(dòng)與土樣充分接觸。2 d后開始每天檢查大蠟螟幼蟲的死亡情況。根據(jù)大蠟螟幼蟲的死亡情況及時(shí)補(bǔ)充幼蟲數(shù)量以便能誘集到足夠多的昆蟲線蟲。如有發(fā)現(xiàn)死蟲及時(shí)挑出，單頭擺放到White trap裝置中收集侵染期線蟲（Infective Juveniles，IJs），連續(xù)觀察15 d。

逐日觀察White trap裝置中有無線蟲游出。當(dāng)有線蟲出現(xiàn)時(shí)，則收集線蟲，并采用濾紙法以活體大蠟螟老熟幼蟲為寄主進(jìn)行回接，如果大蠟螟死亡且采用White trap裝置可再次從死亡蟲體上收集到線蟲后，則表明該土樣中存在昆蟲病原線蟲。

1.3 線蟲對(duì)大蠟螟幼蟲的致病力

用無菌水調(diào)整EPN濃度至200 IJs/mL，在直徑15 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)鋪兩層濾紙，然后用移液槍吸取不同線蟲液各2 mL均勻滴加到濾紙上，接入大蠟螟老熟幼蟲30頭，用保鮮膜封口后在室溫（26±1）℃黑暗條件下培養(yǎng)。以滴加無菌水的處理作為對(duì)照。接種后24 h檢查記錄試蟲的死亡情況，統(tǒng)計(jì)死亡率，連續(xù)觀察5 d，各處理重復(fù)3次。

1.4 線蟲對(duì)紅脈穗螟3齡幼蟲的致病力

根據(jù)1.3的試驗(yàn)結(jié)果，選取校正死亡率超過50%的EPN種群測(cè)試其對(duì)紅脈穗螟3齡幼蟲的致病力。將供試EPN 的3齡感染期幼蟲（IJs）以無菌水稀釋至200、300、400、500、600 IJs/mL，在直徑9 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)鋪兩層濾紙，然后用移液槍吸取各處理線蟲液1 mL滴加到濾紙上，接入紅脈穗螟3齡幼蟲20頭，置于室溫（26±1）℃黑暗條件培養(yǎng)，以相同量的無菌水處理作為對(duì)照。處理后24 h檢查試蟲存活情況，以昆蟲針輕觸蟲體無自主反應(yīng)為死亡標(biāo)準(zhǔn)，各處理重復(fù)3次。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

致病力數(shù)據(jù)采用試蟲的校正死亡率進(jìn)行分析，差異顯著性比較采用鄧肯氏新復(fù)極差檢驗(yàn)法（DMRT法）。根據(jù)黃劍等[14]的方法采用Excel統(tǒng)計(jì)軟件求出毒力回歸方程及LC50（以IJs/mL表示）、LC50的95%置信區(qū)間等，毒力差異顯著性以LC50的95%置信區(qū)間是否重疊為標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 海南省檳榔園中EPN分布情況

在海南省中、東部市縣檳榔主要產(chǎn)區(qū)的檳榔園中共采集土樣150份，經(jīng)室內(nèi)采用大蠟螟誘集及回接進(jìn)行EPN的收集。在150份土樣中共檢測(cè)到含EPN的土樣12個(gè)，線蟲的檢出率為8%。除了海口采集的9個(gè)土樣和保亭采集的 10個(gè)土樣中未檢出線蟲外，其余市縣所采集的土樣中均檢出昆蟲病原線蟲。其中，從屯昌、定安和萬寧三個(gè)市縣采集的土樣中檢出的帶線蟲比率相對(duì)較高，線蟲檢出率分別為12.90%、11.76%和10.00%（表1）。

表1 昆蟲病原線蟲在海南省檳榔園的分布Table 1 EPN distribution in areca plantation of Hainan

在采樣的檳榔園中土壤類型可以分為兩大類，分別是紅壤土和砂壤土，其中紅壤土采樣112個(gè)，從中誘捕到線蟲的有9個(gè)，檢出率為8.04%；砂壤土采樣共38個(gè)，其中有3個(gè)土樣誘捕到EPN，檢出率為7.89%（表2）。

表2 不同類型土壤中的昆蟲病原線蟲檢出率Table 2 Percentage of EPN under different soil types

2.2 EPN對(duì)大蠟螟幼蟲的校正死亡率

將土樣中誘捕到的12個(gè)EPN種群分別接種大蠟螟老熟幼蟲，其致病力的測(cè)試結(jié)果如表3。從表中可以看出，誘捕的 12個(gè)線蟲種群均對(duì)大蠟螟幼蟲具有一定的致病力，但致病力的大小存在較大差異。從處理后24 h的結(jié)果來看，Tc23、Qh04、Da12和Da15四個(gè)線蟲種群對(duì)大蠟螟幼蟲的死亡率均超過10%，但隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，在供試后120 h其累計(jì)死亡率最高均未達(dá)到45%。Tc05、Wn01和Wn09這三個(gè)線蟲種群在短期內(nèi)對(duì)大蠟螟的死亡率較低，如Tc05在24 h時(shí)未發(fā)現(xiàn)死蟲，但隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，到接種后120 h時(shí)，這幾種線蟲對(duì)大蠟螟的死亡率分別為61.11%、72.22%和57.78%，均達(dá)到50%以上，表現(xiàn)出了較強(qiáng)的致病力。

表3 不同病原線蟲對(duì)大蠟螟幼蟲的累積死亡率Table 3 Virulence of EPN against G.mellonella

2.3 不同EPN種群對(duì)紅脈穗螟幼蟲的致病效果

三種EPN種群Tc05、Wn01和Wn09均對(duì)紅脈穗螟3齡幼蟲具有一定的致病性（圖1），且死亡率隨著EPN濃度的升高而增加。其中，Wn01種群對(duì)紅脈穗螟幼蟲的校正死亡率最高，在600 IJs/mL線蟲液處理后24 h校正死亡率達(dá)到86.67%，其次為Tc05和Wn09種群，校正死亡率分別達(dá)到61.67%和65.00%。

圖1 昆蟲病原線蟲不同濃度對(duì)紅脈穗螟3齡幼蟲24 h的致病力Fig.1 Virulences of different concentrations of EPN against 3rd larvae of T.rufivena at 24 h

在昆蟲病原線蟲的毒力分析中，Tc05、Wn01和Wn09種群對(duì)紅脈穗螟3齡幼蟲的LC50分別為504.75、283.70和502.70 IJs/mL，從95%置信區(qū)間來看，Wn01種群與另兩個(gè)種群之間無重疊，這表明Wn01線蟲種群與Tc05和Wn09種群差異顯著（表4）。

表4 不同昆蟲病原線蟲處理對(duì)紅脈穗螟幼蟲的毒力水平Table 4 Toxicity of different EPN to T.rufivena larvae

3 討論

從土壤中誘捕EPN是獲取線蟲資源的一種比較常見的做法，但不同地區(qū)中土壤昆蟲線蟲檢出率變化較大（6%～35%）[15-17]。本文從海南省主要檳榔園中采集的150份土樣中共檢測(cè)到帶線蟲土樣12個(gè)，檢出率為8%，除了?？诤捅Ｍ颖疚礄z出線蟲外，其余市縣所采集的土樣中均檢出昆蟲病原線蟲，由此EPN的分布可能與周邊調(diào)查環(huán)境及本地區(qū)的EPN寄主豐富度有關(guān)。陳書龍等[18]對(duì)河北省的EPN資源調(diào)查發(fā)現(xiàn)，沙土、沙壤土和壤土帶線蟲率分別為8.57%、3.17%和3.36%；谷黎娜[19]研究表明，甘肅省沙壤土和壤土昆蟲線蟲各占37.9%、51.7%，而黏土僅占10.4%。在海南種植檳榔的園區(qū)內(nèi)主要是紅壤土和砂壤土，從土壤類型來看，這兩種土壤中線蟲檢出率分別為8.04%和7.89%，無顯著差異。

由于線蟲的寄生專一性和對(duì)發(fā)生地環(huán)境條件的適應(yīng)性不同，誘捕和篩選當(dāng)?shù)氐腅PN，隨后將高致病力EPN再投放到田間，可更好地發(fā)揮當(dāng)?shù)谽PN控制害蟲的作用[20]。通過測(cè)試對(duì)大蠟螟老熟幼蟲的致病效果，本試驗(yàn)土樣中誘集到的12個(gè)EPN樣本均對(duì)大蠟螟幼蟲具有一定的致病力，但不同EPN間致病力差異顯著，致死效率也不同，其中Tc05、Wn01和Wn09這三個(gè)EPN樣本的致病力相對(duì)較強(qiáng)，到接種后120 h對(duì)大蠟螟的校正死亡率均超過50%。因而選擇這幾種線蟲測(cè)試其對(duì)檳榔害蟲紅脈穗螟的致病力，結(jié)果表明這3個(gè)線蟲種群對(duì)紅脈穗螟3齡幼蟲具有很強(qiáng)的致病作用，其中Wn01種群的致病效果最好，在600 IJs/mL線蟲液處理后24 h校正死亡率達(dá)到86.67%，LC50為283.70 IJs/mL。紅脈穗螟主要以幼蟲在檳榔花苞內(nèi)、心葉部位危害，害蟲隱蔽性強(qiáng)，棲息環(huán)境濕度大且避光，這與EPN的生存所需條件基本一致，有利于昆蟲線蟲的存活及侵染，如能在生產(chǎn)上進(jìn)行應(yīng)用將可能取得較好的防治效果。