李 驊,趙汝東,李 超,吳 鑫,劉玉濤,丁 想

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院，南京210031）

我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，秸稈資源豐富，每年秸稈總產(chǎn)量高達(dá)8.9 億t，是秸稈產(chǎn)量最多的國(guó)家[1-2]，其中水稻秸稈在農(nóng)作物秸稈中占30%，約為2.7 億t[3]。隨著我國(guó)農(nóng)村地區(qū)經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展以及居民燃料消費(fèi)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，同時(shí)農(nóng)作物秸稈產(chǎn)量不斷增加，而秸稈高值化資源化利用率偏低，廣大農(nóng)村地區(qū)仍有大量秸稈作為廢棄物在田間焚燒導(dǎo)致環(huán)境污染[4-8]。秸稈飼料化作為一種秸稈綜合利用方式能解決污染問題，提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)附加值，為農(nóng)民增收，每噸秸稈進(jìn)行飼料化利用帶來的經(jīng)濟(jì)效益約為700 元[9]，因此秸稈飼料化具有廣闊的發(fā)展前景。目前秸稈飼料化處理的主要方法有物理處理、化學(xué)處理和生物處理[10-11]。物理處理法包括切短、粉碎、蒸煮以及熱噴等，可破壞秸稈纖維結(jié)構(gòu)，使秸稈變得松軟；化學(xué)處理法包括堿化和氨化法，可破環(huán)秸稈物理結(jié)構(gòu)，提高動(dòng)物消化率，但處理過程使用的試劑會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染；生物處理法是在處理后的秸稈中加入有益菌劑進(jìn)行發(fā)酵，可以改變秸稈物理性狀，使其變得松軟，提高采食速度和適口性，還可增加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，所以成為目前處理秸稈的首選途徑。

祁宏偉等[12-13]研究發(fā)現(xiàn)破壞秸稈蠟質(zhì)層可更利于微生物發(fā)酵；楊旭等[14-16]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌在微貯發(fā)酵秸稈時(shí)為優(yōu)勢(shì)菌，可以有效抑制腐敗菌生成；高麗娟等[17-18]發(fā)現(xiàn)外源乳酸菌有益于稻草秸稈發(fā)酵。國(guó)內(nèi)秸稈飼料化研究多聚焦菌劑種類對(duì)發(fā)酵效果的影響[19]，而秸稈含水率、長(zhǎng)度等因素對(duì)于工藝的產(chǎn)業(yè)化有關(guān)。因此，本研究以添加菌種比例、菌劑添加量、含水率、秸稈長(zhǎng)度為考察因素，以秸稈發(fā)酵質(zhì)量得分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探究水稻秸稈微貯發(fā)酵制備動(dòng)物飼料的最優(yōu)工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2019 年11 月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)浦口校區(qū)（118.7°E，32.1°N）內(nèi)進(jìn)行，稻稈為南粳5055 水稻秸稈，經(jīng)自然風(fēng)干后使用。試驗(yàn)使用的3種菌種購(gòu)買于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。酸標(biāo)準(zhǔn)液、指示劑、鹽酸等主要試劑均為分析純，采購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 單因素試驗(yàn) 設(shè)置四個(gè)單因素變量（植物乳桿菌∶啤酒酵母∶枯草芽孢桿菌添加比例、菌劑添加量、含水率、秸稈長(zhǎng)度）。在常規(guī)秸稈發(fā)酵試驗(yàn)中[20]，菌劑添加量通常在0.30%，含水率通?？刂圃?0%，動(dòng)物進(jìn)食長(zhǎng)度通常在3cm[21]，在此基礎(chǔ)上每個(gè)因素取五個(gè)水平進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每個(gè)處理3次重復(fù)，具體試驗(yàn)變量及參數(shù)如表1。

表1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Single factor experiment

1.2.2 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析結(jié)果設(shè)計(jì)四因素四水平正交試驗(yàn)，每個(gè)處理3次重復(fù)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Design of orthogonal experimental

1.3 試驗(yàn)步驟

利用MRS 培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基、綜合PDA 瓊脂培養(yǎng)基分別接種植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌、啤酒酵母，在28～30℃的振蕩器中培養(yǎng)2～10d；按每1kg 水加入10g 白糖用于提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。選取未霉變的秸稈，利用帶刻度剪切板將秸稈切割至1，2，3，4，5cm 備用；每組稱取50g秸稈，根據(jù)各組菌劑添加量以及菌劑配比加入3 種菌液，根據(jù)含水率添加蒸餾水，添加食鹽（0.8%）促進(jìn)菌種繁殖，添加尿素（2%）作為氮源供菌種合成蛋白質(zhì)，然后與秸稈混合均勻后放入食品保鮮袋中，利用真空封口機(jī)抽出保鮮袋空氣并密封，放到恒溫箱中25℃發(fā)酵28d。

1.4 數(shù)據(jù)檢測(cè)及處理

揮發(fā)性脂肪酸測(cè)定采用Agilent7820A 氣相色譜儀，配備FID 檢測(cè)器，Agilent122-7032 色譜柱。色譜條件：進(jìn)樣口溫度240℃；柱溫初始50℃，保持5min，最終達(dá)到250℃，保持4min；檢測(cè)器溫度為250℃；氣體流速：載氣（氮?dú)狻?9.99%）25mL·min-1；氫氣≥99.99%，30mL·min-1；空氣，400mL·min-1，進(jìn)樣量為0.5uL。氨態(tài)氮測(cè)定采用水楊酸鈉—次氯酸鈉法[22]；粗蛋白測(cè)定采用GB/T6432-94 凱氏定氮法[23]；纖維成分測(cè)定采用范氏（Van Soest）法[23]；粗脂肪測(cè)定采用GB6433-1994 索氏抽提法[24]；黃曲霉毒素測(cè)定采用黃曲霉素試紙方法[25]。 采用Excel 2010和Origin 9.1對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理以及圖表的繪制，SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)分析

由圖1a可知，菌種配比對(duì)揮發(fā)性脂肪酸含量變化影響較小，而氨態(tài)氮波動(dòng)較大，可選取氨態(tài)氮含量較低的菌種組合進(jìn)行正交試驗(yàn)，故選取植物乳桿菌∶啤酒酵母∶枯草芽孢桿菌添加比例1∶1∶1，2∶1∶1，2∶2∶1，2∶1∶2 四個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。由圖1b 可知，當(dāng)菌劑添加量在0.15%～0.25% 時(shí)揮發(fā)性脂肪酸及氨態(tài)氮含量波動(dòng)較大，且當(dāng)添加量為0.2% 時(shí)乳酸含量最高，乙酸、丁酸、丙酸及氨態(tài)氮的含量最低，故在0.20% 兩側(cè)選取0.10%、0.15%、0.20%、0.25% 四個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。由圖1c可知，當(dāng)含水率在50%～70% 時(shí)各項(xiàng)指標(biāo)變化顯著，且在60% 時(shí)，正向指標(biāo)乳酸含量最高，其余負(fù)向指標(biāo)含量最低，因此取50%、55%、60%、65% 為正交試驗(yàn)四個(gè)水平。由圖1d 可知，當(dāng)秸稈長(zhǎng)度在2～4cm 時(shí)乳酸含量最高，乙酸含量最低，而其余指標(biāo)波動(dòng)較小，因此以乳酸及丁酸含量作為判斷依據(jù)，并考慮到長(zhǎng)度對(duì)動(dòng)物進(jìn)食影響[21]，故選2，3，4，5cm進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2 正交試驗(yàn)分析

采用L16（44）正交試驗(yàn)確定水稻發(fā)酵秸稈制備生物飼料的最佳參數(shù)。表2 為正交試驗(yàn)處理參數(shù)，表3 為綜合評(píng)分計(jì)算結(jié)果。以青貯飼料質(zhì)量評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)[26]作為評(píng)定體系，該體系采用有機(jī)酸評(píng)分與氨態(tài)氮評(píng)分結(jié)合的方法，先將有機(jī)酸評(píng)分除以2，然后與氨態(tài)氮得分相加，即可獲得綜合評(píng)分。由表3 可知，乙酸值處于5.1%～8.4%之間，對(duì)綜合評(píng)分無影響，正向指標(biāo)乳酸和負(fù)向指標(biāo)丁酸的波動(dòng)對(duì)綜合評(píng)分影響較大。本試驗(yàn)運(yùn)用綜合平衡分析法，首先找出各指標(biāo)最優(yōu)水平，列出對(duì)各指標(biāo)的主次因子順序然后綜合平衡，找出最優(yōu)的因素水平。

表3 正交試驗(yàn)各處理綜合評(píng)分計(jì)算結(jié)果Table 3 Orthogonal test each processing comprehensive score calculation result

由表4 可知，Ki值最大為最優(yōu)水平。A 因素最優(yōu)為K3A和K4A，B 因素為K3B，C 因素為K3C，D 因素為K2D，即為A3B3C3D2和A4B3C3D2為理論上的最優(yōu)水平組合。在評(píng)分最佳組Z8（A2B4C3D2）與Z14（A4B3C3D1）中，植物乳桿菌∶啤酒酵母∶枯草芽孢桿菌分別為2∶1∶2 與2∶2∶1。由于啤酒酵母菌蛋白質(zhì)含量高，較多的啤酒酵母菌可提供更多的營(yíng)養(yǎng)蛋白，而過多的枯草芽孢桿菌會(huì)抑制菌劑繁殖，結(jié)合K4A（2∶2∶1）為理論最優(yōu)水平，所以最佳菌種比例取2∶2∶1；菌劑添加量的理論最優(yōu)值為K3B（0.2%）；含水率的理論最優(yōu)值為K3C，與試驗(yàn)最優(yōu)評(píng)分組水平一致，即最優(yōu)含水率為60%；K2D（3cm）為理論最優(yōu)秸稈長(zhǎng)度，結(jié)合圖1d，當(dāng)秸稈長(zhǎng)度為3cm時(shí)的指標(biāo)要優(yōu)于2cm發(fā)酵指標(biāo)，而且秸稈越短需要消耗更多粉碎功率，所以3cm為最優(yōu)秸稈長(zhǎng)度。綜上得到秸稈發(fā)酵最優(yōu)工藝參數(shù)：添加菌種比例2∶2∶1，菌劑添加量0.20%，含水率60%，秸稈長(zhǎng)度3cm。通過表4中的極差R分析，四個(gè)因素對(duì)指標(biāo)的影響排序?yàn)椋航斩掗L(zhǎng)度＞含水率＞添加菌種比＞菌種添加量。

表4 正交試驗(yàn)秸稈質(zhì)量評(píng)分極差分析Table 4 Analysis of orthogonal experimental straw quality score

圖1 多因素變量對(duì)揮發(fā)性脂肪酸中各酸占比的影響Figure 1 Effect of multi-factor variables on the proportion of each acid in volatile fatty acids

2.3 理論最佳發(fā)酵條件驗(yàn)證

最佳發(fā)酵條件為：菌劑添加量0.20%，秸稈長(zhǎng)度3cm，含水率60%，植物乳桿菌、啤酒酵母和枯草芽孢桿菌比例為2∶2∶1，由于理論最佳條件不在正交試驗(yàn)組內(nèi)，對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)驗(yàn)證。試驗(yàn)地點(diǎn)在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)浦口校區(qū)，開始于2019年12月12日，樣品放置到恒溫箱中以25℃發(fā)酵28d。

2.3.1 飼料質(zhì)量分析 正交試驗(yàn)最優(yōu)評(píng)分為：綜合評(píng)分74，VFA 48，氨態(tài)氮50。由表5可知，氨態(tài)氮含量普遍比正交試驗(yàn)內(nèi)的最優(yōu)組稍高，所以氨態(tài)氮評(píng)分稍低，但是揮發(fā)性脂肪酸的含量成分較好，VFA得分普遍比正交試驗(yàn)內(nèi)的最優(yōu)組高，綜合評(píng)分分別為75.5，75，73。只有一組稍低于正交試驗(yàn)最優(yōu)組的74分，所以正交試驗(yàn)結(jié)果可靠。

表5 貯存性能指標(biāo)Table 5 Index of storage performance

2.3.2 營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)分析 由表6可知，相對(duì)于未處理秸稈，發(fā)酵秸稈的蛋白質(zhì)含量最高提升至9.13%，差異顯著（p＜0.05），但與天然牧草[27]仍有差距；粗脂肪含量相對(duì)于普通秸稈減少，原因是在微貯過程中，由于揮發(fā)性脂肪酸的消耗，導(dǎo)致了粗脂肪含量的減少[28]；粗纖維的含量相對(duì)于未處理秸稈也有少量的減少，其主要原因是由于選定的菌種對(duì)纖維素的分解作用不明顯。

表6 營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)變化Table 6 Changes in nutritional indicators

2.4 微貯秸稈結(jié)構(gòu)變化分析

由圖2（卡爾·蔡司SIFMA300 1k 倍電鏡掃描）可知，自然風(fēng)干的水稻秸稈外表面有小幅度的凹凸，且布滿顆粒狀凸點(diǎn)，內(nèi)表面呈現(xiàn)光滑平整的狀態(tài)。而微貯后的水稻秸稈存在明顯的差異，外表面的光澤度明顯下降，主要原因是發(fā)酵過程中秸稈外表面蠟質(zhì)層被部分去除，內(nèi)外表面有明顯的撕裂、破壞，同時(shí)存在有片狀脫落及分層的傾向，且發(fā)酵后秸稈變得松軟。

圖2 微貯處理秸稈內(nèi)外表面結(jié)構(gòu)變化Figure 2 Changes of internal and external surface structure of straw after micro-storage micro-storage

2.5 微貯秸稈安全性分析

國(guó)標(biāo)中對(duì)于青貯以及微貯秸稈飼料無黃曲霉素標(biāo)準(zhǔn)具體要求[29]，參考玉米花生餅以及豆粕的要求（玉米花生餅，黃曲霉毒素含量＜50μg·kg-1；豆粕，黃曲霉毒素含量＜30μg·kg-1），以殘留限量20μg·kg-1為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)發(fā)酵樣品利用黃曲霉毒素檢測(cè)試紙測(cè)得結(jié)果陰性，表明微貯發(fā)酵后飼料黃曲霉毒素B1濃度小于檢測(cè)限20μg·kg-1，符合飼料安全標(biāo)準(zhǔn)。

3 討論與結(jié)論

秸稈飼料化是一種高值的秸稈綜合處理方式，但目前由于一系列技術(shù)問題尚未得到解決，導(dǎo)致我國(guó)秸稈飼料化進(jìn)程尚未得到較為突出的進(jìn)步。數(shù)據(jù)表明，發(fā)達(dá)國(guó)家如美國(guó)的秸稈綜合利用率達(dá)到90%，英國(guó)達(dá)到70%，韓國(guó)水稻秸稈的飼料化利用率達(dá)到80% 以上，而目前我國(guó)秸稈飼料化利用率僅占可收集資源量的20%[30]，秸稈飼料化在我國(guó)具有廣闊的發(fā)展前景。

本研究利用試驗(yàn)得出的最優(yōu)參數(shù)對(duì)水稻秸稈進(jìn)行微貯發(fā)酵處理，分析其營(yíng)養(yǎng)成分發(fā)現(xiàn)秸稈粗蛋白含量由5.16% 最高提升至9.13%，蛋白質(zhì)變化顯著（p＜0.05），這與徐焱等[31]研究結(jié)果一致，雖然粗蛋白有顯著提升，但低于天然牧草粗蛋白含量，分析其原因是由于在發(fā)酵過程中含有粗蛋白的酵母菌大量繁殖提升了飼料粗蛋白含量，但提供的數(shù)量有限，為解決這一問題可以在微貯時(shí)添加一些農(nóng)副產(chǎn)品比如豆粕、麩皮等來進(jìn)一步提高粗蛋白含量。粗纖維含量雖有小幅度下降但是差異不顯著（p＞0.05），主要原因是試驗(yàn)中添加的啤酒酵母菌對(duì)纖維素的分解作用較小，而像白腐真菌[32]這種對(duì)纖維素分解能力較強(qiáng)，但由于其生存環(huán)境與試驗(yàn)中的菌種的環(huán)境差異較大而未添加。試驗(yàn)中經(jīng)過微貯過的秸稈變得松軟有酵香，有利于改善動(dòng)物適口性，提高進(jìn)食效率，這與劉興義等[33]研究結(jié)果一致。由于試驗(yàn)是單包少量試驗(yàn)，未能進(jìn)行喂養(yǎng)試驗(yàn)。

本研究利用單因素試驗(yàn)及四因素四水平正交試驗(yàn)得到了水稻秸稈微貯發(fā)酵理論最佳參數(shù)：菌比2∶2∶1（植物乳桿菌∶啤酒酵母∶枯草芽孢桿菌），菌劑添加量0.20%，含水率60%，秸稈長(zhǎng)度3cm。對(duì)各個(gè)因素影響秸稈飼料質(zhì)量評(píng)分的結(jié)果進(jìn)行極差分析可得出對(duì)秸稈飼料質(zhì)量評(píng)分影響大小順序?yàn)椋航斩掗L(zhǎng)度＞含水率＞菌比＞菌種添加量，試驗(yàn)結(jié)果可為水稻秸稈微貯制備動(dòng)物飼料產(chǎn)業(yè)化提供參考。