王 輝，鄭 淋，趙謀明，劉通訊

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 廣州 510640）

從日常飲食中獲取額外的抗氧化物質(zhì)來提升機(jī)體的氧化應(yīng)激水平，從而保護(hù)機(jī)體的正常運(yùn)轉(zhuǎn)已成為學(xué)界共識(shí)[1]。金槍魚（Scombridae），肉質(zhì)細(xì)膩，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，富含蛋白質(zhì)、脂肪、維生素及各種微量元素，是國(guó)際營(yíng)養(yǎng)協(xié)會(huì)推薦的綠色、無污染、健康食品。已有大量學(xué)者從金槍魚副產(chǎn)物中制備并鑒定出具有抗氧化活性的肽段。例如：Zhang等[2]對(duì)金槍魚魚頭模擬胃腸道消化，其消化產(chǎn)物顯示出良好的鐵離子還原能力以及抑制脂質(zhì)過氧化的活性；Hsu 等[3]從蒸煮過的金槍魚罐頭汁中，采用定向酶解分離出具有很強(qiáng)的DPPH 自由基清除能力的3 條肽：Pro-Val-Ser-His-Asp-His-Ala-Pro-Glu-Tyr，Pro-Ser-Asp-His-Asp-His-Glu 和Val-His-Asp-Tyr；Ding 等[4]從金槍魚骨中分離出具有抗氧化活性的膠原肽。目前，研究人員主要采用不同的商業(yè)酶，從金槍魚中制備具有抗氧化活性的肽段[5-6]，而鮮有金槍魚肉消化后產(chǎn)物的抗氧化活性的變化研究。

熱處理作為一種食物常用的加工方式，其過程常伴隨著原材料物理、化學(xué)性質(zhì)的變化。Wong等[7]發(fā)現(xiàn)經(jīng)熱處理的雞肉肌原纖維蛋白中的總巰基含量顯著降低，蛋白的疏水作用增強(qiáng)，并發(fā)生降解。Ding 等[8]發(fā)現(xiàn)鯉魚肌原纖維蛋白和肌球蛋白在熱處理后發(fā)生降解并形成較為穩(wěn)定的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。Bell 等[9]發(fā)現(xiàn)在熱處理金槍魚的過程中，魚肉失重率隨變性溫度的改變而變化。上述研究說明熱處理金槍魚肉可能會(huì)改變?nèi)獾慕M織結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，影響消化過程，進(jìn)而影響其活性。本文以金槍魚肉為原料，分別對(duì)未加熱及沸水浴處理10 min 的金槍魚肉進(jìn)行模擬胃腸道消化，比較各階段消化產(chǎn)物的水解度、消化率、分子質(zhì)量分布及其抗氧化活性，探討熱處理對(duì)金槍魚肉體外消化特性及其消化產(chǎn)物抗氧化活性的影響；分析金槍魚肉加熱前、后在不同溶劑中的溶解度及其SDSPAGE 圖譜的變化，從分子層面闡明熱處理對(duì)金槍魚肉的結(jié)構(gòu)及其消化產(chǎn)物特性和抗氧化活性的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)鰭金槍魚肉，廣州市南沙區(qū)十九涌海鮮市場(chǎng)。

胃蛋白酶（P7000）、胰酶（P7545）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（AAPH）、鄰苯二甲醛（OPA）、牛血清蛋白、抑肽酶、桿菌肽、維生素B12，美國(guó)Sigma 公司；二硫蘇糖醇（DTT）、尿素，廣州鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；合成肽VYY、LPEEV，吉爾生化（上海）有限公司；2，2-聯(lián)喹啉-4，4-二甲酸二鈉（BCA）試劑盒，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C 型pH 計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；恒溫?fù)u床，常州澳華儀器有限公司；KND-2C 凱氏定氮儀，上海纖檢儀器有限公司；CR22G高速離心機(jī)，日本Hitachi 公司；R2L-100KPS 冷凍干燥機(jī)，日本CHRIST 公司；垂直電泳儀，美國(guó)Bio-Rad Laboratories 公司；C300 化學(xué)發(fā)光成像儀，美國(guó)Azure Biosystems 公司；HPLC 高效液相色譜儀，美國(guó)Waters 公司；Varioskan Flash 全波長(zhǎng)掃描多功能讀數(shù)儀、凝膠色譜柱（G2000 SWXL，7.8 mm×300 mm），美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 金槍魚肉體外消化產(chǎn)物的制備 參照Z(yǔ)heng 等[10]的方法并修改進(jìn)行模擬胃腸道消化。稱取8 份新鮮金槍魚肉糜，每份25 g，分別加入75 g去離子水混勻，其中4 份沸水浴10 min，另4 份不做處理；加入5 mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至2.0，加入肉糜蛋白質(zhì)量4%的胃蛋白酶，37 ℃下分別消化1，2 h，加入2 mol/L NaOH 調(diào)pH 值至7.5，加入肉糜蛋白質(zhì)量4%的胰酶，37 ℃下分別消化1，2 h，沸水浴10 min 滅酶，在4 ℃下，12 000×g 離心15 min 后，取上清液，分別得到消化1，2，3，4 h 的消化液，并在-20 ℃保存。

1.3.2 金槍魚肉粉的制備 稱取2 份新鮮金槍魚肉糜，每份25 g，分別加入75 g 去離子水混勻，1份沸水浴10 min，另1 份不做處理，凍干。凍干的金槍魚肉用中藥粉碎機(jī)粉碎，過200 目篩，得到不同處理?xiàng)l件下的金槍魚肉粉末。

1.3.3 體外消化產(chǎn)物水解度的測(cè)定 在Nielsen等[11]的方法上做適當(dāng)修改，根據(jù)消化產(chǎn)物定氮的結(jié)果，將酶解液蛋白質(zhì)量濃度稀釋成0.5 mg/mL，以0.1 g/L 的絲氨酸溶液為標(biāo)準(zhǔn)品，用OPA 法測(cè)定其吸光度，并計(jì)算酶解液的水解度。

1.3.4 金槍魚肉消化率的測(cè)定 稱量消化液上清液質(zhì)量m，根據(jù)國(guó)標(biāo)GB 5009.5[12]使用凱式定氮法測(cè)得消化液中的蛋白含量為w，消化率按公式（1）計(jì)算。

式中，P——消化率（%）；m——消化液上清液的質(zhì)量（g）；w——消化液中的蛋白含量（%）；M——消化所用金槍魚肉質(zhì)量（g）；n——金槍魚肉中蛋白含量（%）。

1.3.5 測(cè)定消化產(chǎn)物體外抗氧化能力 ABTS 法根據(jù)Nielsen 等[11]的方法做適當(dāng)改進(jìn)。在96 孔微孔板中加入50 μL 樣品溶液，再加入150 μL ABTS·+溶液，以同等體積的磷酸鹽緩沖液（PBS）和不同濃度的水溶性維生素E（Trolox）作為空白對(duì)照與標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑，在30 ℃條件下孵育一定時(shí)間后，測(cè)定其在734 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值，分別記為Asample、ATrolox和Acontrol。根據(jù)公式（2）計(jì)算清除率，并且以Trolox 溶液的濃度和對(duì)應(yīng)的ABTS·+清除率建立直線回歸方程。根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品的ABTS·+清除率，并折算成對(duì)應(yīng)的Trolox 濃度（TEAC），單位為μmol TE（Trolox 當(dāng)量）/g。

式中，Asample——樣品的吸光度值；Acontrol——空白對(duì)照的吸光度值。

ORAC 法在Dávalos 等[13]方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。整個(gè)反應(yīng)在pH 值為7.4，75 mmol/L 的PBS條件下進(jìn)行。20 μL 樣品與120 μL 濃度為116.67 nmol/L 的熒光素鈉混合，在37 ℃下孵育15 min，加入60 μL 濃度為40 mmol/L 的AAPH，混勻，利用多功能酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng)485 nm、發(fā)射波長(zhǎng)520 nm 的條件下讀數(shù)，每2 min 讀數(shù)1 次，連續(xù)讀100 min。以PBS 為空白對(duì)照，不同濃度的Trolox作為標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑。熒光衰退面積按公式（3）計(jì)算。

式中，f0——第0 分鐘的讀數(shù)；fi——每分鐘的讀數(shù)。凈積分面積按公式（4）計(jì)算。式中，AUC樣本——樣品的熒光衰退面積；AUC空白對(duì)照——空白對(duì)照的熒光衰退面積。

建立不同Trolox 濃度與其netAUC 的直線回歸方程，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品的ORAC 值，并折算成對(duì)應(yīng)的Trolox 濃度（TEAC），單位為μmol TE（Trolox 當(dāng)量）/g。

1.3.6 消化產(chǎn)物分子質(zhì)量的分布 依據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T 22492-2008[14]測(cè)定方法并進(jìn)行改進(jìn)，測(cè)定金槍魚肉消化產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布。采用TSK2000 凝膠柱（G2000SWXL 分析柱，7.8 mm×300 mm）；流動(dòng)相0.1%TFA；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫25 ℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品為牛血清蛋白、抑肽酶、桿菌肽、維生素B12和合成肽VYY、LPEEV。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算消化產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布。

1.3.7 蛋白溶解度的測(cè)定 將處理好的金槍魚肉粉以料液比1∶20，分別溶解在PBS（pH 7.5，20 mmol/L 含0.5 mol/L NaCl）；PBS（pH 7.5，20 mmol/L含0.5 mol/L NaCl）+50 mmol/L DTT；PBS（pH 7.5，20 mmol/L 含0.5 mol/L NaCl）+8 mol/L Urea；PBS（pH 7.5，20 mmol/L 含0.5 mol/L NaCl）+50 mmol/L DTT+8 mol/L Urea 溶液中，并在室溫（25 ℃）攪拌1 h；在10 000×g，4 ℃條件下離心15 min 取上清。稱量上清液質(zhì)量，用BCA 法測(cè)定上清液蛋白濃度，由此計(jì)算蛋白的溶解率。

1.3.8 SDS-PAGE 電泳 采用連續(xù)體系SDSPAGE 凝膠電泳，并在Lametsch 等[15]與Zhou 等[16]的基礎(chǔ)上改進(jìn)，稱取對(duì)照組和熱處理組金槍魚肉粉末，將其溶解于還原型上樣緩沖液，配制成終質(zhì)量濃度為2 mg/mL 的金槍魚肉溶液，沸水浴5 min，隨后在10 000×g，4 ℃條件下離心10 min，吸取10 μL 上清液上樣。電泳采用含10%丙烯酰胺的分離膠和含5%丙烯酰胺的濃縮膠，調(diào)整電流為15 mA。凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色液染色，并用甲醇與乙酸的混合洗脫液脫色。采用化學(xué)發(fā)光儀觀察蛋白亞基變化。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有指標(biāo)均重復(fù)3 次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差” 表示。數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 20.0（SPSS Inc.，Chicago IL，USA） 進(jìn)行單因素方差分析，并采用Duncans 多重比較法進(jìn)行顯著性差異的分析（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消化時(shí)間產(chǎn)物的消化率及水解度的變化

為探討熱處理對(duì)金槍魚肉體外消化特性的影響，分別對(duì)熱處理組與對(duì)照組的金槍魚肉進(jìn)行模擬胃腸道消化，測(cè)定其在不同消化時(shí)間下的消化率及水解度。由圖1、圖2可知，金槍魚肉的消化率與水解度均隨消化時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，并在4 h 達(dá)到最大值，熱處理組與對(duì)照組的消化率分別為68.58%和87.61%，水解度分別為27.23%，32.88%。熱處理組金槍魚肉在1～4 h 內(nèi)消化率都顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），其消化率分別比對(duì)照組低21.26%，21.97%，17.99%，21.72%。這說明金槍魚魚肉蛋白在消化過程中被胃蛋白酶或胰酶水解，生成肽鏈，增加了游離氨基酸的數(shù)量，未經(jīng)過熱處理的金槍魚肉比熱處理后消化效果更顯著。因此，金槍魚肉熱處理可能不利于消化。

圖1 熱處理對(duì)金槍魚肉體外消化率的影響Fig.1 Effect on digestibility of heat treated tuna meat in vitro

圖2 熱處理對(duì)金槍魚肉體外消化產(chǎn)物水解度的影響Fig.2 Effect in DH of production of heat treated tuna digestion in vitro

2.2 不同消化時(shí)間產(chǎn)物體外抗氧化能力的變化

評(píng)價(jià)物質(zhì)體外抗氧化能力的方法有許多種，ORAC 法與ABTS 法由于操作簡(jiǎn)單且測(cè)定結(jié)果相對(duì)穩(wěn)定，以及兩者結(jié)果趨勢(shì)相關(guān)性較好被諸多學(xué)者采用[17-18]。

ABTS 是一種水溶性自由基，能夠反映親水性肽的總抗氧化能力[19]。金槍魚肉消化產(chǎn)物ABTS 自由基清除活性隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，在消化4 h 后達(dá)到最大，對(duì)照組與熱處理組的ABTS 清除活性的TEAC 值分別達(dá)到1 028.90 μmol TE/g與931.56 μmol TE/g（TEAC）。這說明在模擬胃腸道消化過程中，生成了大量具有清除ABTS 自由基和過氧自由基活性的肽段，大量的氨基酸殘基暴露出來與ABTS 自由基結(jié)合并清除自由基；隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，生成肽鏈的數(shù)量也逐漸增加，其抗氧化能力也逐漸增強(qiáng)，這與金槍魚肉的消化率和水解度的結(jié)果一致。熱處理組經(jīng)消化2，3，4 h 后，其活性均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），TEAC值分別降低了7.38%，13.64%，9.46%。這說明熱處理不利于金槍魚肉在胃腸消化過程中釋放具有ABTS 自由基清除活性的肽段。這可能是由于熱處理過程中，魚肉中的蛋白質(zhì)在高溫條件下形成更加致密的結(jié)構(gòu)[20]，不利于酶與蛋白質(zhì)的結(jié)合，以釋放出活性較強(qiáng)的肽段。此外，熱處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，使原本具有抗氧化活性的氨基酸序列被破壞，可能也是導(dǎo)致熱處理組抗氧化活性降低的原因之一。

ORAC 是一種通過測(cè)定抑制氫原子轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)弱來評(píng)價(jià)其抗氧化能力的方法，與ABTS 兩種測(cè)定方法相結(jié)合能夠較好的反映該物質(zhì)的抗氧化能力。經(jīng)過熱處理的金槍魚肉消化產(chǎn)物的抗氧化活性均低于對(duì)照組。除了2 h 的消化產(chǎn)物外，其它消化時(shí)間的產(chǎn)物自由基清除能力與對(duì)照組相比均沒有顯著性差異（P＞0.05）。在經(jīng)過胃蛋白酶消化2 h 后，金槍魚肉消化產(chǎn)物過氧自由基清除能力達(dá)到最大值，對(duì)照組與熱處理組分別為815.71 μmol TE/g 與692.83 μmol TE/g。反常的是，在胰酶繼續(xù)消化1 h 后消化產(chǎn)物的自由基清除活性稍下降，并在胰酶繼續(xù)消化2 h 后活性又有明顯提升，這可能是由于不同肽對(duì)AAPH 自由基清除能力不同。造成與ABTS 結(jié)果有差異的原因可能是由于ORAC 與ABTS 方法的反應(yīng)機(jī)制不同，ABTS 是基于抑制電子轉(zhuǎn)移的原理來測(cè)定其抗氧化活性[21]。

圖3 熱處理對(duì)金槍魚肉在不同消化時(shí)間下的ABTS 自由基清除能力的影響Fig.3 Effect on ABTS radical-scavenging activity of heat treated tuna meat at different digestion times

圖4 熱處理對(duì)金槍魚肉在不同消化時(shí)間下的ORAC 自由基清除能力的影響Fig.4 Effect on ORAC radical-scavenging activity of heat treated tuna meat at different digestion times

2.3 不同消化時(shí)間產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布

體外消化產(chǎn)物分子質(zhì)量分布測(cè)定結(jié)果如表1所示。隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，金槍魚肉消化產(chǎn)物分子質(zhì)量大于5 ku 的含量一直呈下降趨勢(shì)，小于1 ku 含量呈增加趨勢(shì)。熱處理組金槍魚肉蛋白經(jīng)消化2 h 與4 h 后分子質(zhì)量主要小于1 ku，占比分別為30.08%，61.80%，而對(duì)照組在相同條件下顯著高于熱處理組（P ＜0.05），所占比為33.32%，66.93%。結(jié)合不同消化時(shí)間的產(chǎn)物抗氧化活性不同，表明肽的抗氧化活性可能與分子質(zhì)量的大小有關(guān)，分子質(zhì)量較小的肽段可能具有更強(qiáng)的抗氧化活性[22-23]，這可能是由于大分子肽具有一定的空間位阻，阻礙了肽與自由基發(fā)生作用。You 等[24]從泥鰍中分離具有抗氧化活性的肽段，也發(fā)現(xiàn)小分子質(zhì)量的肽段所具有的抗氧化活性最高。由此可以推測(cè)，發(fā)揮消化產(chǎn)物抗氧化活性的肽的分子質(zhì)量主要集中在小于1 ku 的范圍內(nèi)。

表1 熱處理金槍魚肉對(duì)不同消化時(shí)間的產(chǎn)物分子質(zhì)量的分布占比的影響Table 1 Effect of heat treated tuna meat on distribution of product molecular weight at different digestion times

2.4 不同溶劑下的蛋白溶解度的變化

PBS 能夠保護(hù)溶解的蛋白質(zhì)原始構(gòu)象不發(fā)生改變，DTT 是一種還原劑，能夠破壞蛋白質(zhì)中的二硫鍵，提高蛋白質(zhì)的溶解度，而尿素能夠破壞蛋白質(zhì)中的氫鍵，使蛋白質(zhì)分子展開，非極性基團(tuán)暴露出來，從而降低蛋白質(zhì)在水中的溶解度。由圖5可知，熱處理組的金槍魚蛋白在不同溶劑中的溶解度均小于對(duì)照組，熱處理組的消化殘?jiān)赑BS 中的溶解度最小，分別為18.77%與1.14%，且熱處理組溶解度顯著低于對(duì)照組，由于蛋白質(zhì)受到高溫的影響，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性聚集，使得蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，原來在分子內(nèi)部的一些非極性基團(tuán)暴露在外[25]，降低了蛋白質(zhì)與水的結(jié)合作用，破壞了蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象從而降低了金槍魚肉蛋白的溶解度；在PBS 中加入尿素與DTT 均能夠增加蛋白質(zhì)的溶解度，并且在PBS、尿素和DTT 混合溶劑中的溶解度最大，分別為74.21%與55.24%，這是由于高溫促使蛋白形成新的二硫鍵等共價(jià)鍵[26]，從而形成更加致密的結(jié)構(gòu)，從而阻礙溶劑分子進(jìn)入蛋白內(nèi)部，導(dǎo)致蛋白溶解度降低。雖然尿素會(huì)降低蛋白質(zhì)的溶解度，但是張忠慧[27]在研究大豆分離蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)，高濃度的尿素可以降低溶液的極性，同時(shí)降低溶液的介電常數(shù)，而低介電常數(shù)環(huán)境能夠有效促進(jìn)肽氫鍵的形成，從而導(dǎo)致蛋白之間的氫鍵重新形成，從而增加了蛋白質(zhì)的溶解度，這與本試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果相一致。同時(shí)尿素使蛋白變性，三維結(jié)構(gòu)展開，暴露出蛋白質(zhì)內(nèi)部的二硫鍵，進(jìn)一步增加了蛋白質(zhì)在DTT 溶液中的溶解度。

圖5 熱處理對(duì)金槍魚肉在不同溶劑中的溶解度的影響Fig.5 Effect on solubility in different solvent of heat treated tuna meat

2.5 金槍魚肉蛋白的SDS-PAGE 分析

為了進(jìn)一步探究金槍魚肉蛋白亞基在熱處理后是否發(fā)生變化，對(duì)金槍魚肉蛋白進(jìn)行SDSPAGE 分析。由圖5可知，熱處理組肌球蛋白重鏈和肌鈣蛋白條帶消失，原肌球蛋白條帶變淺，然而在45～60 ku 和35～45 ku 處條帶明顯變深，可能是因?yàn)樵跓崽幚磉^程中這些蛋白質(zhì)變性，降解成分子質(zhì)量更小的蛋白。孫麗[28]在熱處理金槍魚肉時(shí)，發(fā)現(xiàn)大分子質(zhì)量的蛋白條帶消失，同時(shí)出現(xiàn)了小分子質(zhì)量的條帶，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。結(jié)合經(jīng)熱處理的金槍魚肉在不同溶劑中的溶解度的差異，推測(cè)在熱處理過程中，金槍魚肉蛋白發(fā)生變性，改變?cè)械奶烊粯?gòu)象，發(fā)生部分降解，同時(shí)新生成二硫鍵等共價(jià)鍵，形成更加致密的結(jié)構(gòu)，阻礙了酶與蛋白質(zhì)的結(jié)合，從而降低了金槍魚肉的消化效率，不利于具有抗氧化活性的小分子肽的釋放。

圖6 金槍魚肉蛋白在不同處理?xiàng)l件下的SDS-PAGE 圖Fig.6 SDS-PAGE pattern of protein of tuna under different condition

3 結(jié)論

本研究表明熱處理不利于金槍魚肉的消化及抗氧化肽的釋放，在熱處理過程中金槍魚肉蛋白質(zhì)發(fā)生降解，同時(shí)伴隨著蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，金槍魚肉蛋白間生成新的共價(jià)鍵，形成更加致密的結(jié)構(gòu)，阻礙了蛋白與消化酶的結(jié)合。本研究結(jié)果對(duì)金槍魚肉深加工具有指導(dǎo)意義。