張開屏，趙艷紅，李權威，閆 娜，呂金積，張海榮，田建軍*，靳 燁

（1內蒙古商貿職業(yè)學院食品工程系 呼和浩特 010070 2內蒙古農業(yè)大學食品科學與工程學院 呼和浩特 010018 3內蒙古草原晶鑫食品有限公司 內蒙古巴彥淖爾 015000）

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是可以發(fā)酵糖類產生乳酸的無芽孢、革蘭氏染色陽性（G+）、厭氧或專性厭氧細菌的通稱[1]。1857年巴斯德首次發(fā)現(xiàn)乳酸菌，1908年Metchnikoff 在發(fā)酵酸奶中發(fā)現(xiàn)乳酸菌的抗氧化作用[2]?？蒲腥藛T逐漸發(fā)現(xiàn)，乳酸菌不僅可以改變食品的風味，提高食品的營養(yǎng)價值，還具有抑菌，降膽固醇，抗氧化等功能特性[3-4]。乳酸菌在生長過程中產生的醋酸、甲酸、丁酸、乳酸等代謝物能夠降低培養(yǎng)體系的pH 值，從而抑制一些不耐酸雜菌的生長[5]。除此之外，有些乳酸菌能夠產生具有生物活性的蛋白質、多肽等物質[6]，這些物質具有抑菌和抗氧化等功能特性[7]。乳酸菌的抗氧化體系主要分為2 個部分：一部分是活性氧（Reactive oxygen species，ROS）自由基（Free radical）清除系統(tǒng)，另一部分是氧化還原調控系統(tǒng)[8]。ROS、自由基清除系統(tǒng)阻止各種ROS 和自由基的生成，清除已經形成的ROS 和自由基，從而防御ROS 和自由基對細胞的進一步危害[9]。機體內的ROS 主要包括羥自由基（·OH）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、超氧陰離子（O2-）和過氧化氫（H2O2），在分子水平上，這些ROS 可與細胞靶點發(fā)生反應，導致蛋白質變性、功能喪失、核酸分子水平上發(fā)生突變，形成分子水平上的氧化應激反應[10]。

如今，乳酸菌的抗氧化特性引起廣泛關注[11-12]，對乳酸菌抗氧化基因的研究也有眾多報道。如Kobatake 等[13]發(fā)現(xiàn)加氏乳桿菌SBT2055 通過激活JNK 信號增加Nrf2 蛋白水平，上調Sod1-3、Trx1、Hmox1 和NQO1 等靶基因mRNA 表達，從而增強抗氧化應激防御能力。katA 基因是標記H2O2酶的基因，H2O2酶（EC1.11.1.6）屬于生物體內抗氧化酶中的一種，在動物、植物、微生物中廣泛存在，H2O2酶能夠催化細胞內H2O2分解，在細胞中起到抗逆作用[14]。1998年Hammes 等[15]首次提出清酒乳桿菌具有katA 基因。2005年Jamet 等發(fā)現(xiàn)katA 在活菌和共生菌中均受氧調控，katA 表達僅在自由生活菌的指數生長階段檢測到，是外源H2O2誘導的唯一的H2O2酶基因[16]。2008年Najjari 等[17]提出清酒乳桿菌具有編碼血紅素依賴的觸酶活性的katA基因。2011年努爾古麗·熱合曼等[18]通過研究katA基因的檢測方法，發(fā)現(xiàn)通過特異性PCR 引物可以將混合乳酸菌種群中的清酒乳桿菌和其它乳酸菌區(qū)分開。

目前，乳酸菌抗氧化特性的研究主要集中在乳酸菌完整細胞和發(fā)酵上清液的研究上。如Lee等[19]對植物乳桿菌（L.plantarum）KCTC3099 的完整細胞抗氧化活性的研究表明，完整細胞對脂質體過氧化具有高抑制作用，抑制率為38.6%，并且通過試驗發(fā)現(xiàn)該菌株對超氧陰離子自由基具有一定的清除能力。對乳酸菌抗氧化基因的表達方面還鮮有綜合的分析，本試驗通過抗氧化基因在乳酸菌中的表達和抗氧化基礎指標來研究乳酸菌的抗氧化特性，為以后在分子水平上研究乳酸菌抗氧化作用機理提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳桿菌：ZF6、ZF8、ZF13、ZF22、TR1-1-3、X31為內蒙古農業(yè)大學食品科學與工程學院肉品科學實驗室保藏、鑒定菌株。

TPY 培養(yǎng)基，北京陸橋技術有限責任公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

PCR 儀（VERITI 96WELL），美國Applied Biosystems；凝膠成像系統(tǒng)（Gel Dox XRt）、電泳儀（PowerPac），美國BIORAD；酶標儀（SYNERGY H1），美國Bio Tek 公司；微量紫外分光光度計（80-3006-61），英國BioDrop；高速冷凍離心機（Centrifuge 5430R），德國Eppendorf。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌發(fā)酵上清液和完整細胞菌懸液的制備 發(fā)酵上清液：菌株傳至3 代，1 000 r/min 離心20 min，收集上清液，即為發(fā)酵上清液。

完整細胞菌懸液的制備：將培養(yǎng)好的乳酸菌3 代菌液移至離心管中，離心后收集沉淀的菌體并用PBS 洗滌，然后在10 000 r/min 條件下離心15 min，再次收集菌體，重復3 次，最后在菌體中加入PBS 緩沖液，所得溶液即為完整細胞菌懸液。

1.3.2 清除羥自由基能力測定 參照文獻[20]和[21]，根據結果按公式（1）計算樣品的羥自由基清除率。

式中，AS——1 mL 的鄰二氮菲溶液+1 mL PBS 溶液+1 mL 樣品+1 mL FeSO4溶液+1 mL H2O2溶液的OD510nm值；Ab——1 mL 的鄰二氮菲溶液+1 mL PBS 溶液+1 mL 蒸餾水+1 mL FeSO4溶液+1 mL 蒸餾水的OD510nm值；A0——1 mL 的鄰二氮菲溶液+1 mL PBS 溶液+1 mL 蒸餾水+1 mL FeSO4溶液+1 mL H2O2溶液的OD510nm值。

1.3.3 清除DPPH 自由基能力測定 參照文獻[22]，根據結果按公式（2）計算樣品的DPPH 清除率。

式中，A1——1 mL 的DPPH 溶液+1 mL 樣品的OD517nm值；A2——1 mL 無水乙醇+1 mL 樣品的OD517nm值；A0——1 mL DPPH 溶液+1 mL 無 水 乙醇的OD517nm值。

1.3.4 清除超氧陰離子自由基能力的測定 參照文獻[23]，根據測定結果按公式（3）計算樣品的超氧陰離子自由基清除率。

式中，A0——空白樣吸光度；AS——待測樣品吸光度。

1.3.5 乳酸菌H2O2耐受性的測定 按體積分數2%將培養(yǎng)好的菌液分別接種在添加H2O2的TPY培養(yǎng)基中，H2O2的起始濃度分別為0.00，0.40，0.70，1.00 mmoL/L，37 ℃培養(yǎng)48 h，間隔12 h 取菌液，測定其OD600nm值，共測定4 次[24]。

1.3.6 乳酸菌DNA 的提取 使用生工生物工程（上海） 股份有限公司細菌DNA 基因組抽提試劑盒，將3 代細菌培養(yǎng)液振蕩混勻取1.5～2 mL 至離心管中，在4 ℃，10 000 r/min 條件下離心1 min，上清液倒入廢液缸，參照試劑盒提取工藝執(zhí)行，DNA 于-20 ℃條件下保存。

1.3.7 PCR 擴增 katA 基因檢測，PCR 條件：上游引物702F：5'-AATTGCCTTCTTCCGTGTA，下游引物310R：5'-AGTTGCGCACAATTATTTTC[25]。

PCR 反應體系（25 μL）：DNA 模板1 μg/L，PCR 緩沖液（1.5 mmol/L MgCl2），0.8 mmol/L dNTPmix，每個引物0.8 μmol/L，2U Taq DNA 聚合酶。

反應程序：首先94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30 個循環(huán)；末端延伸72 ℃、10 min。用1.0 g/100 mL 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 及PCR 產物[26]。

1.4 數據統(tǒng)計分析

使用軟件SPSS 19.0 和Origin 7.5 對試驗數據進行分析和做圖，全部數據均采取“平均數±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌清除羥自由基能力分析

羥自由基（·OH）是重要的活性氧物質之一，試驗通過測定乳酸菌對羥自由基的清除能力來驗證6 種乳酸菌的抗氧化性能。6 種乳酸菌的發(fā)酵上清液與完整細胞菌懸液的羥自由基清除率的對比結果如圖1所示。

由圖1可知，6 株試驗菌株上清液和菌懸液對羥自由基都有一定的清除能力，試驗菌株上清液和菌懸液對羥自由基的清除率的均值分別為31.71%和51.82%，上清液對·OH 清除能力約是菌懸液清除能力的0.61 倍。其中5 株乳酸菌的菌懸液對羥自由基清除能力整體上比發(fā)酵上清液的清除能力強，且ZF13 和TR1-1-3 菌株上清液與菌體懸浮液對羥自由基清除率差異顯著（P<0.05），其主要原因是乳酸菌的菌懸液代表乳酸菌胞內物質，而發(fā)酵上清液主要代表胞外代謝產物，可推測試驗菌株對羥自由基的清除能力主要是由胞內物質決定的，胞外代謝物起協(xié)同作用。

圖1 發(fā)酵上清液與完整細胞菌懸液的羥自由基清除率的對比圖Fig.1 Comparison of hydroxyl radical scavenging rates between fermentation supernatant and intact cell suspension

ZF13、TR1-1-3、ZF6 的菌懸液對羥自由基的清除率分別為69.24%，71.81%，65.84%，清除能力相對較強且與其它菌株相比差異顯著（P<0.05）。ZF22 和X31 的菌懸液對羥自由基的清除率分別為29.63%，26.98%，清除能力相對較弱。

試驗結果表明，不同乳酸菌對·OH 的清除效果不同，且清除·OH 的活性主要是由胞內物質決定，胞外代謝物起協(xié)同作用。TR1-1-3 的完整細胞菌懸液對羥自由基的清除能力最強為71.81%，X31 菌株對羥自由基的清除能力最弱，上清液和菌懸液清除率分別為14.98%和26.98%

2.2 乳酸菌清除DPPH 自由基能力分析

DPPH 是一個穩(wěn)定的自由基，在體外抗氧化性評價體系中被作為抗氧化成分的典型代表[3]；早在1958年就被提出可作為定量測定抗氧化能力的物質，到目前為止仍被廣泛運用[27]。乳酸菌發(fā)酵上清液與完整細胞菌懸液的DPPH 自由基清除率的對比結果如圖2所示。

圖2 發(fā)酵上清液與完整細胞菌懸液的DPPH 自由基清除率的對比圖Fig.2 Comparison of DPPH free radical scavenging rate between fermentation supernatant and intact cell suspension

由圖2可知，6 株試驗菌株上清液和菌懸液對DPPH 自由基都有一定的清除能力，ZF6、TR1-1-3、ZF13、X31、ZF8、ZF22 上 清 液 對DPPH 自 由基的清除率分別為87.37%，86.46%，78.78%，78.06%，74.54%，73.05%，菌株ZF6 和菌株TR1-1-3 上清液對DPPH 自由基的清除能力相對較強，試驗菌株上清液和菌懸液對DPPH 自由基的清除率的均值分別為79.71%和7.21%，上清液對DPPH 自由基清除能力約是菌懸液清除能力的11.06 倍。

試驗結果表明，不同乳酸菌對DPPH 自由基的清除效果不同，清除DPPH 自由基的活性物質主要存在于發(fā)酵上清液中，胞內物質起輔助協(xié)同作用。上清液對DPPH 自由基的清除能力相對較強的菌株是ZF6 和TR1-1-3，其清除率分別達到了87.37%和86.46%。

2.3 乳酸菌清除超氧陰離子（O2-·）自由基能力分析

在人體內存在一定數量的超氧陰離子（O2-·）時，若不發(fā)生化學反應一般不會對人體造成傷害，然而如果與羥基（·OH）結合，其產物會導致細胞DNA 遭到損壞，可能會引起體內的脂質過氧化，加快機體衰老的過程，并誘發(fā)心腦血管疾病，嚴重時還會破壞人類機體功能。乳酸菌發(fā)酵上清液與菌體懸浮液清除超氧陰離子自由基結果如圖3所示。

由圖3可知，6 株試驗菌株上清液和菌懸液對超氧陰離子自由基都有一定的清除能力，TR1-1-3、ZF8、ZF22、ZF6、X31、ZF13 的上清液對超氧陰離子自由基的清除率分別為99.18%，94.94%，93.77%，92.40%，88.15%，87.15%，菌株TR1-1-3和ZF8 的上清液對超氧陰離子自由基的清除能力相對較強，試驗菌株上清液和菌懸液對超氧陰離子自由基的清除率的均值分別為92.60%%和22.53%，上清液對超氧陰離子自由基平均清除率約是菌懸液清除率的4.11 倍。

圖3 發(fā)酵上清液與完整細胞菌懸液對超氧陰離子自由基清除率對比圖Fig.3 Comparison of superoxide free radical scavenging rate between fermentation supernatant and intact cell suspension

試驗結果表明，不同乳酸菌對超氧陰離子自由基的清除效果不同，清除超氧陰離子自由基的活性物質主要存在于發(fā)酵上清液中，胞內物質起輔助協(xié)同作用。上清液對超氧陰離子自由基的清除能力相對較強的菌株是TR1-1-3 和ZF8，其清除率分別達到了99.18%和94.94%，相對較強的菌株是X31 和ZF13，其清除率分別達到了88.15%和87.15%

2.4 乳酸菌對H2O2 的耐受能力分析

H2O2是一種強氧化劑，一定含量的H2O2會對人體造成不同程度的傷害，乳酸菌對H2O2的耐受性是篩選緩解氧化應激乳酸菌的重要指標之一[28]。6 株乳酸菌對于不同濃度H2O2溶液的耐受性測試結果如表1所示。

表1 乳酸菌在不同濃度H2O2 溶液中的吸光度Table 1 Absorbance of lactic acid bacteria in different concentrations of H2O2 solution

（續(xù)表1）

由表1可知，6 株乳酸菌都具有一定的H2O2耐受性，并且隨著發(fā)酵時間的延長，OD 值逐漸升高，說明隨著發(fā)酵時間的延長6 株乳酸菌的抗氧化性在不斷增強，其中在培養(yǎng)12 h 后的OD 值最低，說明此時乳酸菌的抗氧化性最低，培養(yǎng)48 h后OD 值最高，說明此時乳酸菌的抗氧化性最高。ZF6、ZF8、ZF13、ZF22、TR1-1-3 的OD 值無論在哪個時間段都大于1，而X31 的OD 值普遍小于1，說明ZF6、ZF8、ZF13、ZF22、TR-1-3 這5 株菌對H2O2的耐受性良好，而X31 對H2O2的耐受性較弱。

加入H2O2的菌液在培養(yǎng)12 h 后對乳酸菌的生長具一定影響，其中，濃度為1 mmol/L 的H2O2溶液對乳酸菌的生長抑制最大，而加入H2O2的菌液在培養(yǎng)24，36，48 h 后，除菌株X31 外，對其它乳酸菌的生長幾乎沒有造成影響，說明菌株在H2O2濃度為0～1 mmol/L 范圍內，對H2O2有一定的耐受能力。試驗結果表明，具有潛在的抗氧化能力的乳酸菌，對H2O2具有一定的耐受能力。

2.5 抗氧化katA 基因的特異性PCR 檢測結果分析

katA 基因是標記H2O2酶的基因，受氧的調控，是外源H2O2誘導的唯一的H2O2酶基因[18]。應用katA 特異性引物對6 株乳酸菌株進行PCR 擴增（702F：5'-AATTGCCTTCTTCCGTGTA，310R：5'-AGTTGCGCACAATTATTTTC），結果如圖4所示。

圖4 乳酸菌katA 基因條帶PCR 產物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products of katA gene from 6 lactic acid bacterial strains

ZF6、ZF8、ZF13、ZF22、TR1-1-3 共5 株乳酸菌都能擴增出長度為410 bp（1 bp=1 堿基對）的明亮的電泳條帶，表明這5 株乳酸菌含有抗氧化基因katA 的序列。X31 檢測結果為陰性，表明在X31 中不存在標記H2O2酶的抗氧化基因katA，與前面乳酸菌對自由基及其H2O2的耐受性試驗結果一致，均表明X31 的抗氧化能力較弱。

試驗結果表明，通過表觀數據乳酸菌對超氧陰離子（O2-·）、羥自由基（·OH）、DPPH 自由基的清除率以及對過氧化氫（H2O2）的耐受性，結合katA 基因特異性PCR 反應可以作為抗氧化乳酸菌判定的檢測方法。

3 結論

試驗結果表明，不同乳酸菌對羥（·OH）、DPPH 和超氧陰離子（O2-·）自由基的清除效果不同，試驗菌株清除·OH 自由基的活性主要是由胞內物質決定的，而清除DPPH 和超氧陰離子（O2-）主要是由乳酸菌上清液中的代謝產物決定。菌株TR1-1-3 對3 種自由基的清除能力都比較強，清除率分別為71.81%，86.46%，99.18%，而菌株X31對羥自由基（·OH）和超氧陰離子（O2-）的清除率最低且與菌株TR1-1-3 差異顯著（P<0.05）。除了菌株X31 外，其它試驗菌株在H2O2濃度為0～1 mmol/L 范圍內，對H2O2有一定的耐受能力，且在12～48 h 培養(yǎng)時間內，隨著培養(yǎng)時間的延長，耐受性逐漸增強?？寡趸痥atA 基因的特異性PCR 檢測結果僅X31 為陰性，其它菌株均為陽性。

綜上所述，通過表觀數據乳酸菌對超氧陰離子（O2-）、羥自由基（·OH）、DPPH 自由基的清除率以及對過氧化氫（H2O2）的耐受性，結合katA 基因特異性PCR 反應可以作為抗氧化乳酸菌判定的檢測方法。