高馨悅，嚴(yán)理，劉頭明

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部麻類生物學(xué)與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410205)

植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)換的過程稱作開花誘導(dǎo)，是高等植物生命周期中最重要的過程之一，這一過程受植物內(nèi)部多種基因和外部環(huán)境(如光照、溫度等)影響[1]。隨著近年來分子生物學(xué)的高速發(fā)展，在擬南芥和水稻等模式植物中，分離并鑒定出大量的開花相關(guān)基因。前人研究[2-3]明確了控制植物開花至少有6條主要途徑：光周期途徑、春化途徑、赤霉素途徑、溫敏途徑、自主途徑和年齡依賴途徑。這些途徑對(duì)不同環(huán)境和植物體內(nèi)的各種因子產(chǎn)生反應(yīng)并轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的新信號(hào)，最后將新信號(hào)傳遞給開花整合因子，由其促進(jìn)花分生組織特異基因的表達(dá)，誘導(dǎo)花的形成。FT(FLOWERING LOCUS T)是開花誘導(dǎo)過程中最重要的整合因子之一，在成花轉(zhuǎn)變中起著至關(guān)重要的作用，所有調(diào)控途徑幾乎都匯集于FT[4]。

FT基因能促進(jìn)植物開花的功能最早是在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的。經(jīng)前人研究，F(xiàn)T基因是在擬南芥葉片中被誘導(dǎo)表達(dá)，其蛋白質(zhì)由葉片經(jīng)過韌皮部移動(dòng)到達(dá)莖頂端組織[5-7],在頂端分生組織中FT蛋白與FLOWERING LOCUS D (FD)和14-3-3蛋白互作并形成復(fù)合體，共同促進(jìn)下游開花基因的表達(dá)，從而促進(jìn)開花[8]。在水稻中，分離出的Hd3a基因編碼的蛋白與擬南芥的FT基因編碼的蛋白高度同源，同樣是在葉片中表達(dá)、合成并轉(zhuǎn)運(yùn)到頂端分生組織，并于合適的光照條件下促進(jìn)植株開花[6]。FT基因編碼的小分子蛋白為175個(gè)氨基酸，屬于磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(phosphatidyle-thanolamine-binding protein, PEBP)家族基因，哺乳動(dòng)物中的PEBP蛋白能結(jié)合磷脂酰乙醇胺，植物中的PEBP磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白是植物生物膜結(jié)構(gòu)上的主要磷脂，發(fā)揮重要的蛋白質(zhì)識(shí)別和信號(hào)傳導(dǎo)作用[9]。

苧麻屬于短日照雙子葉植物，具有誘導(dǎo)成花的臨界日長(zhǎng)和敏感期[10]。延遲苧麻開花，有利于延長(zhǎng)其營(yíng)養(yǎng)體生長(zhǎng)時(shí)間，提高作物的纖維產(chǎn)量。而大蒜屬于長(zhǎng)日照單子葉植物。苧麻基因組未發(fā)生近期的全基因組復(fù)制事件，因此其基因組較小(約270 Mb)(數(shù)據(jù)源于NCBI PRJNA663427)，而大蒜基因組近期發(fā)生了兩次全基因組復(fù)制事件，導(dǎo)致其基因組達(dá)到16.9 Gb[11]。由于大蒜在進(jìn)化過程中發(fā)生了數(shù)次全基因組復(fù)制事件，使得大蒜基因家族擴(kuò)張并出現(xiàn)基因冗余現(xiàn)象，致使大蒜FT基因家族中的基因數(shù)量增多。在前人對(duì)植物FT基因的研究中，多是用單子葉的水稻和雙子葉的擬南芥進(jìn)行比較，少有研究將其他單、雙子葉植物的FT基因進(jìn)行比較，因此，單、雙子葉FT之間的差異和聯(lián)系還存在一定空白。本研究中單子葉大蒜和雙子葉苧麻，該兩種植物中的FT家族基因在日前的研究中還鮮有報(bào)道，并且兩種植物中的FT進(jìn)化機(jī)制當(dāng)前仍不清楚。因此，本研究以雙子葉植物苧麻和單子葉植物大蒜為對(duì)象，基于大蒜與苧麻中FT蛋白的同源性比較進(jìn)一步分析，旨在為今后單、雙子葉的成花研究奠定一定基礎(chǔ)，為改良苧麻和大蒜這兩種經(jīng)濟(jì)作物的開花時(shí)間提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 苧麻和大蒜的基因篩選

以“flowering locus T”為關(guān)鍵詞，對(duì)苧麻和大蒜的基因組注釋數(shù)據(jù)分別進(jìn)行搜索。為保證搜索到的基因?yàn)槠r麻和大蒜FT基因，將得到的基因所編碼的蛋白序列在NCBI的Conserved Domains(http:// www. Ncbi. nlm. nih. gov/ Structure/ cdd/ wrpsb. cgi)上完成保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，并將這些FT蛋白序列在NCBI中與其他物種FT蛋白進(jìn)行比對(duì)，篩選出具有PEBP保守結(jié)構(gòu)域的苧麻和大蒜FT基因。

1.2 序列比對(duì)

收集擬南芥成花基因FT(AtFT)[12]和水稻中Hd3a[13]基因(見表1)。結(jié)合AtFT蛋白與Hd3a蛋白的保守結(jié)構(gòu)域及本研究中篩選到的苧麻和大蒜中FT基因所編碼的蛋白保守結(jié)構(gòu)域，利用DNAMAN軟件進(jìn)行蛋白多序列比對(duì)。最后采用MEGA 7.0軟件對(duì)AtFT/Hd3a蛋白和苧麻、大蒜中FT基因所編碼的全長(zhǎng)氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析，分析模型采用Neighbor-Joining法，每個(gè)點(diǎn)計(jì)算1000次。

表1 苧麻和大蒜FT家族基因列表

2 結(jié)果與分析

2.1 苧麻和大蒜FT家族基因篩選

根據(jù)NCBI中公布的青葉苧麻[14]基因組(序列號(hào)：PRJNA663427)的注釋基因，以“flowering locus T”為關(guān)鍵詞對(duì)基因組注釋進(jìn)行搜索，得到2個(gè)注釋為“flowering locus T”的苧麻基因，這兩個(gè)基因編碼蛋白具有完整的PEBP結(jié)構(gòu)域序列，推測(cè)是全長(zhǎng)cDNA。根據(jù)Sun等[11]完成的“二水早”大蒜基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，以“flowering locus T”為關(guān)鍵詞對(duì)基因組基因注釋進(jìn)行搜索，得到25個(gè)注釋為“flowering locus T”的大蒜基因，其中14個(gè)大蒜基因不具有完整的PEBP結(jié)構(gòu)域，故予以剔除。最后篩選到2個(gè)苧麻FT基因和11個(gè)大蒜FT基因，這些結(jié)果說明大蒜FT基因家族發(fā)生了顯著擴(kuò)張。

2.2 FT蛋白序列比對(duì)

在擬南芥中，AtFT蛋白的功能主要是由其自身蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定的，其中大多數(shù)殘基的突變對(duì)其蛋白的開花調(diào)控功能影響不顯著。但是，其中5個(gè)殘基(Tyr-85、Glu-109、Trp-138、Gln-140 和 Asn-152) 中的任意一個(gè)發(fā)生突變都可能導(dǎo)致其功能的完全改變[15-16]。為了研究苧麻和大蒜FT基因間的序列類似性，將已知模式植物擬南芥FT基因以及水稻Hd3a基因的編碼蛋白序列與本研究鑒定的2個(gè)苧麻FT基因和11個(gè)大蒜FT基因進(jìn)行多蛋白保守結(jié)構(gòu)域序列比對(duì)。從圖1可以看出，擬南芥FT和水稻Hd3a蛋白與雙子葉植物苧麻Bnt01G000036基因和Bnt02G002054基因編碼的氨基酸序列在Tyr-85、Glu- 109、Trp-138、Gln-140和Asn-152這5個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基處非常保守，而大蒜11個(gè)FT所編碼的蛋白中，只有4個(gè)FT蛋白(Asa2G02821.1、Asa6G00732.1、Asa7G06383.1和Asa7G06386.1)在這5處氨基酸殘基位點(diǎn)非常保守。Asa0G05138.1、Asa8G04470.1、Asa6G06199.1和Asa6G06200.1 4個(gè)蛋白都有一個(gè)關(guān)鍵氨基酸發(fā)生變化，其中Asa0G05138.1和Asa8G04470.1是在152位的Ser發(fā)生變異，而Asa6G06199.1和Asa6G06200.1則在138位Val發(fā)生變異；Asa6G00188.1有兩個(gè)關(guān)鍵氨基酸發(fā)生變異，分別為138位的Val和152位的Ser；Asa8G01025.1以及Asa8G01036.1與苧麻FT蛋白、AtFT和Hd3a等蛋白差異最大，只在第85位的關(guān)鍵氨基酸一致，其余4個(gè)關(guān)鍵氨基酸皆不同，分別變異為Val(第109位)、Val(第138位)、His(第140位)、Try(第152位)。

圖1 FT保守結(jié)構(gòu)域序列比對(duì)Fig.1 FT conserved domain sequence alignment

2.3 FT家族基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

為進(jìn)一步分析苧麻和大蒜FT基因與AtFT/Hd3a基因之間的同源性，對(duì)這 15個(gè)FT同源蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果如圖2所示。15個(gè)FT蛋白被分為3類，其中苧麻蛋白Bnt01G000036、Bnt02G002054，大蒜蛋白Asa2G02821.1、Asa6G00732.1、Asa8G04470.1、Asa0G05138.1與AtFT/Hd3a蛋白同屬一類蛋白亞家族；大蒜蛋白Asa6G06199.1、Asa6G06200.1、Asa7G06383.1、Asa7G06386.1屬于第二類FT蛋白亞家族；而大蒜蛋白Asa6G00188.1、Asa8G01025.1和Asa8G01036.1則屬于第三類FT蛋白亞家族。由圖2可知，只有4個(gè)大蒜FT基因與苧麻FT基因歸于一類，其余7個(gè)大蒜基因又分成兩類。此外，深入分析第一個(gè)FT蛋白亞家族發(fā)現(xiàn)，苧麻FT同源蛋白Bnt01G000036、Bnt02G002054與擬南芥AtFT和水稻的Hd3a具有非常近的同源關(guān)系，而大蒜的4個(gè)FT同源蛋白進(jìn)化關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。其中，Bnt01G000036與AtFT、Hd3a的蛋白序列一致性分別為67.98%和69.44%，而Bnt02G002054與AtFT、Hd3a的蛋白序列一致性分別為76.70%和77.78%。這些研究結(jié)果說明苧麻FT同源蛋白在進(jìn)化過程中非常保守，而大蒜FT同源蛋白在擴(kuò)張后發(fā)生了大量變異。

圖2 FT蛋白序列進(jìn)化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of FT protein sequence

3 結(jié)論與討論

苧麻纖維是我國(guó)特色天然纖維，其從莖皮中剝?nèi)。瑢儆跔I(yíng)養(yǎng)體纖維。苧麻莖葉中富含粗蛋白，也被廣泛用作飼草。較長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)體生長(zhǎng)周期有利于提高苧麻的纖維和嫩莖葉產(chǎn)量。苧麻對(duì)光周期敏感，短日照條件下苧麻易開花，從而降低營(yíng)養(yǎng)體產(chǎn)量。因此，培養(yǎng)光周期鈍感的苧麻品種，延遲苧麻開花時(shí)間，是苧麻高產(chǎn)育種的重要目標(biāo)，同時(shí)有助于實(shí)現(xiàn)苧麻產(chǎn)業(yè)向低緯度的東南亞地區(qū)轉(zhuǎn)移。FT基因是植物成花過程中重要的因子之一，F(xiàn)T功能和蛋白結(jié)構(gòu)在許多植物中高度保守。小麥[17]、大麥[18]、棉花[19]、豌豆[20]、黑麥草[21]等諸多植物中的FT蛋白在Tyr-85、Glu-109、Trp-138、Gln-140和Asn-152這5個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基位點(diǎn)皆與AtFT/Hd3a蛋白相一致，這些植物FT蛋白都與植物開花調(diào)控相關(guān)。本研究在苧麻中鑒定到兩個(gè)FT家族成員，其序列上都與AtFT/Hd3a高度同源。由此也可說明，苧麻中的FT基因家族在進(jìn)化上是非常保守的，這為研究苧麻的開花進(jìn)化機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，而苧麻中成花素FT蛋白的鑒定也為開展苧麻的光鈍感品種選育提供了基因資源。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著大蒜基因組的擴(kuò)張，大蒜FT家族基因數(shù)量也隨之發(fā)生了急劇擴(kuò)張，家族成員達(dá)到了11個(gè)，家族成員過多可能會(huì)出現(xiàn)功能冗余。一般地，如果基因家族成員間功能冗余，當(dāng)某一成員發(fā)生突變，其功能可能會(huì)由其他成員予以補(bǔ)償，而導(dǎo)致個(gè)體性狀并未發(fā)生改變，進(jìn)而將這種基因模式遺傳給后代，以維持物種在自然界中的穩(wěn)定。因此，推測(cè)這是大蒜FT家族成員廣泛擴(kuò)張的一個(gè)可能原因。但由于成員之間蛋白序列發(fā)生了廣泛變異，也可能會(huì)導(dǎo)致部分基因功能分化。在前人的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)T除了調(diào)控植物的開花，還能夠參與植物的其他發(fā)育過程，如塊莖形成、氣孔閉合和低溫響應(yīng)等[22]。在洋蔥和馬鈴薯的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)T蛋白對(duì)于調(diào)控塊莖/鱗莖膨大具有非常關(guān)鍵的作用[23-24]。LEE等[24]發(fā)現(xiàn)洋蔥中有AcFT1-AcFT6共6類FT基因，AcFT1基因可以促進(jìn)鱗莖形成，AcFT4基因抑制鱗莖的形成，AcFT2基因的表達(dá)與開花相關(guān)，而AcFT3、AcFT5和AcFT6基因作用還未被確定。大蒜與洋蔥同屬百合科蔥屬植物且FT家族基因在蛋白序列上都存在廣泛變異。因此，以洋蔥FT基因家族為參照，為今后研究FT家族基因在大蒜生長(zhǎng)發(fā)育中的功能(尤其在開花調(diào)控、鱗莖形成中的功能)提供了一定的幫助。

在以往對(duì)短日照單子葉植物水稻和長(zhǎng)日照雙子葉植物擬南芥的開花調(diào)控研究中發(fā)現(xiàn)，兩者開花調(diào)控存在較大的相似性，同時(shí)又具有一定的差異[25]。本研究進(jìn)一步分析了長(zhǎng)日照單子葉植物大蒜和短日照雙子葉植物苧麻的成花素FT蛋白進(jìn)化，研究結(jié)果進(jìn)一步豐富了對(duì)植物開花進(jìn)化機(jī)制的認(rèn)識(shí)。