賀媛媛 孫倩倩 郭波莉 張 磊

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193)

中藥材粉葛(PuerariaethomsoniiRadix)是豆科植物甘葛藤(PuerariaethomsoniiBenth) 的干燥根。傳統(tǒng)中藥學(xué)上，粉葛主治解肌退熱，具有生津止渴、透疹、升陽(yáng)止瀉、通經(jīng)活絡(luò)以及解酒毒等功效[1]。粉葛富含淀粉、微量元素以及葛根素、大豆苷、大豆苷元等異黃酮類成分，具有降三高、抗心律失常、擴(kuò)張冠狀血管、腦保護(hù)、抗氧化、抗腫瘤以及提高記憶等功效[2]。我國(guó)是粉葛生產(chǎn)大國(guó)，每年日本、東南亞、歐美等國(guó)家從我國(guó)進(jìn)口大量粉葛初級(jí)產(chǎn)品，經(jīng)深加工后生產(chǎn)相關(guān)的藥品和保健品。2012年，世界糧農(nóng)組織等權(quán)威機(jī)構(gòu)已經(jīng)將葛根列入世界六大糧食作物之一[3]。市場(chǎng)對(duì)粉葛的需求量逐年增加，各地種植面積不斷攀升。

葛根素、大豆苷等異黃酮成分含量直接影響粉葛質(zhì)量。不同產(chǎn)地葛根中的總黃酮、葛根素、大豆苷元等含量均存在顯著差異。其中，不同產(chǎn)地葛根中葛根黃酮含量相差約3倍，葛根素含量相差約20倍，大豆苷元含量相差約30倍[4]。目前，粉葛市場(chǎng)魚龍混雜，不同產(chǎn)地來(lái)源的粉葛產(chǎn)品品質(zhì)良莠不齊。在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)動(dòng)下，不法生產(chǎn)商以次充好，且虛假標(biāo)簽現(xiàn)象極為嚴(yán)重，粉葛產(chǎn)地的真實(shí)性急需確證[5]。但由于不同地理來(lái)源粉葛特征相似，僅采用傳統(tǒng)的鑒別方法很難準(zhǔn)確鑒別其產(chǎn)地。

前人對(duì)葛根產(chǎn)地溯源研究主要采用紅外光譜[6-8]、熒光[9]和近紅外光譜[10]等方法，通過(guò)測(cè)定其活性成分以判別葛根產(chǎn)地來(lái)源。但活性成分受品種、貯藏時(shí)間等因素影響較大，建立的產(chǎn)地判別模型的穩(wěn)定性有待進(jìn)一步提高。生物體礦質(zhì)元素因其自身不能合成，必需從土壤、水等周圍環(huán)境中獲取，因而帶有其產(chǎn)地特有的地理指紋信息，相比生物體有機(jī)成分而言，礦質(zhì)元素指紋對(duì)農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地鑒別更為穩(wěn)定。目前，礦質(zhì)元素指紋分析已應(yīng)用于糧谷類[11]、果蔬類[12]、茶葉[13]及多種中藥材[14-15]等植物源性農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地溯源[16]。逐步判別分析是在判別分析的基礎(chǔ)上，根據(jù)Wilk’s Lambda準(zhǔn)則分析將數(shù)據(jù)逐步輸入，同時(shí)采用留一法進(jìn)行交叉驗(yàn)證，以此獲得區(qū)分不同地域來(lái)源樣品的最佳判別變量，屬于有監(jiān)督的模式識(shí)別方法。Zhang等[14]采用礦質(zhì)元素指紋對(duì)中寧及中寧周邊枸杞進(jìn)行分析，結(jié)合逐步判別分析表明，經(jīng)回代檢驗(yàn)和交叉驗(yàn)證中寧枸杞的正確判別率分別為95.7%和85.7%。

本研究重點(diǎn)分析礦質(zhì)元素指紋在粉葛產(chǎn)地溯源中的可行性，并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析篩選有效的產(chǎn)地溯源指標(biāo)，旨在為粉葛原產(chǎn)地鑒別提供方法，為維護(hù)粉葛行業(yè)誠(chéng)信體系，保障公平競(jìng)爭(zhēng)，促進(jìn)粉葛產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

本研究采集了43份人工種植粉葛樣品，其中陜西樣品14份、湖北樣品15份、廣西樣品14份，樣品均于2018年12月至2019年1月采收。樣品采集具體地理信息以及種植期間氣象信息見(jiàn)表1。

表1 樣品采樣地地理位置和種植期間氣象信息

選擇各地粉葛樣品種植區(qū)域，根據(jù)區(qū)域面積大小，按照土壤樣品采集技術(shù)規(guī)范采集表層(0～20 cm)土壤樣品；剔除土壤中石子、植物根須等雜物，將土壤樣品混勻，采用四分法去除多余土壤樣品。依照此原則，共采集土壤樣品19份，其中陜西4份、湖北10份、廣西5份。

試驗(yàn)所用試劑包括：硝酸(北京化學(xué)試劑研究所，BV-Ⅲ)、雙氧水(北京化學(xué)試劑研究所，BV-Ⅲ)、氫氟酸(阿拉丁公司，分析純)、高氯酸(北京化學(xué)試劑研究所，優(yōu)級(jí)純)、18.2 MΩ·cm-1超純水(美國(guó)Millipore 公司)、Part#5183-4688環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)液(美國(guó)Agilent公司)、人參標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW 10027，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心)、土壤標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW 07446，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

LGJ-10冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；DE-250中藥粉碎機(jī)，浙江紅景天工貿(mào)有限公司；MARS 240/50微波消解儀，美國(guó)CEM公司；7700電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，美國(guó)Agilent公司；QM -3SP2行星式球磨機(jī)，南京大學(xué)儀器廠。

1.3 樣品測(cè)定

1.3.1 樣品預(yù)處理 粉葛樣品：采收后的粉葛先用自來(lái)水充分清洗去除表皮泥土，后用去離子水沖洗3遍，去皮、切丁，置于冷凍干燥機(jī)對(duì)其進(jìn)行冷凍干燥72 h (-60～-55℃)；凍干樣品用中藥粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過(guò)200目篩后于聚乙烯塑料瓶中密封保存，待測(cè)。

土壤樣品：在自然條件下陰干后，采用球磨儀將土壤磨碎，過(guò)200目篩網(wǎng)，獲得細(xì)粉，裝入聚乙烯塑料袋中保存，待測(cè)。

1.3.2 樣品消解 粉葛樣品：稱取粉葛樣品0.25 g于Teflon消解管中，加入6 mL硝酸，使其與樣品充分反應(yīng)2 h后，再加入2 mL雙氧水，繼續(xù)反應(yīng)0.5 h后，將其有序地放入微波消解儀中消解，以去除樣品中的有機(jī)物。微波消解程序：在1 600 W功率下經(jīng)8 min升溫至120℃，保持2 min；保持功率不變，繼續(xù)升溫5 min至160℃，保持5 min；保持功率不變，升溫5 min至180℃，保持30 min。將消解管從微波消解儀中按序取出，放在180℃趕酸板上進(jìn)行趕酸約40 min后將其定容至100 mL[14]，4℃儲(chǔ)存，備測(cè)。

土壤樣品：稱取土壤樣品0.05 g于Teflon消解罐中，加入8 mL濃硝酸，讓其與樣品充分反應(yīng)2 h后，加入2 mL氫氟酸，將其有序放入微波消解儀進(jìn)行消解，以去除土壤樣品中的有機(jī)物。微波消解程序：升溫10 min使得消解溫度升至120℃，在此溫度下保持4 min；繼續(xù)升溫8 min，使得消解溫度達(dá)到160℃，在此溫度下保持4 min；持續(xù)升溫5 min，待消解溫度達(dá)到185℃，在此溫度下保持25 min，整個(gè)過(guò)程功率始終保持為1 600 W。微波消解結(jié)束后，再加入1 mL高氯酸，然后有序放在185℃趕酸板上趕酸50 min，定容至100 mL塑料方瓶[14]，于4℃儲(chǔ)存?zhèn)錅y(cè)。

1.3.3 樣品元素含量測(cè)定 取10 mL上述溶液注入到待測(cè)試塑料試管中，在電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)上進(jìn)行B、Na、Mg、P、K、Ca、Mn、Co、Cu、Zn、Rb、Sr、Mo、Cd、Cs、Ba、La、Ce、Pr、Nd、Sm和Ti元素含量的測(cè)定。ICP-MS儀器參數(shù)如下：射頻功率(radio frequency, RF)為1 280 W，冷卻氣流速為1.47 L·min-1，霧化室溫度為2℃，蠕動(dòng)泵為0.10 rps，氬氣作為載氣，其流速和輔助氣流速均為1 L·min-1。Ge、In和Bi為在線內(nèi)標(biāo)以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)儀器穩(wěn)定性。試驗(yàn)所有樣品經(jīng)3次重復(fù)測(cè)定，當(dāng)內(nèi)標(biāo)元素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差>5% 時(shí)，樣品需重新測(cè)定。本研究粉葛樣品分析選擇GBW 10027人參粉成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為參考材料，土壤樣品選擇GBW 07446土壤成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為參考材料對(duì)試驗(yàn)操作全過(guò)程進(jìn)行控制。標(biāo)準(zhǔn)品回收率均在 85%～110% 之間。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Shaprio-Wilk正態(tài)分析、描述性分析、方差分析(ANOVA)、Duncan’s多重比較。采用比率分析對(duì)各元素中的中位/平均居中變異系數(shù)(coefficient of variation，COV)進(jìn)行計(jì)算，將設(shè)置的新變量K=1作為分母，其余連續(xù)變量作為分子進(jìn)行計(jì)算[17]。采用多元統(tǒng)計(jì)分析中主成分分析(principal component analysis，PCA)、逐步判別分析(stepwise discriminant analysis，SLDA)和分層聚類分析(hierarchical cluster analysis，HCA)對(duì)不同地域來(lái)源樣品進(jìn)行分類，其中采用SIMCA 14.0軟件分析HCA，采用SPSS 22.0軟件分析PCA和SLDA。

2 結(jié)果與分析

2.1 粉葛中礦質(zhì)元素含量特征

對(duì)粉葛中B、Na、Mg、P、K、Ca、Mn、Co、Cu、Zn、Rb、Sr、Mo、Cd、Cs、Ba、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Ti 22種礦質(zhì)元素進(jìn)行Shapiro-Wilk正態(tài)分析(表2)。結(jié)果表明，各地域粉葛中Mg、P、K、Ca、Cu、Zn、Sr元素含量服從正態(tài)分布，其余元素含量在各地域間不完全符合或部分符合正態(tài)分布。對(duì)呈正態(tài)分布的元素取平均值，非正態(tài)分布的元素取其中位數(shù)和四分位數(shù)。粉葛中常量元素含量由大到小依次為K>Ca>P>Mg>Na，其必需微量元素含量呈現(xiàn)Zn>Cu>Mn>Mo>Co>B趨勢(shì)；輕稀土元素含量呈現(xiàn)Ce>La>Nd>Pr>Sm趨勢(shì)，稀土元素可作為產(chǎn)地鑒別的有效指標(biāo)，因?yàn)檫@些元素很容易從土壤轉(zhuǎn)移到植物中[18]。Na、Mn、Co、Mo、Cd、Cs、Ba、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Ti元素的變異系數(shù)均超過(guò)了100%，說(shuō)明不同產(chǎn)地來(lái)源粉葛中礦質(zhì)元素含量有較大的差異。

表2 粉葛中礦質(zhì)元素含量

表2(續(xù))

2.2 不同地域粉葛中礦質(zhì)元素含量差異比較

由表3可知，除B、Cu外，其余礦質(zhì)元素含量在不同產(chǎn)地間均存在不同程度的顯著性差異。Duncan’s多重比較分析結(jié)果表明，不同地域粉葛礦質(zhì)元素含量有其特有的指紋信息。陜西粉葛中Co、Sr、Cd、Ba、La、Ce、Pr、Nd和Sm元素含量最高；湖北粉葛中Ca和Mo含量最高；廣西粉葛中Na、P、K、Zn、Rb和Ti元素含量最高。

表3 不同產(chǎn)地粉葛礦質(zhì)元素含量差異分析

2.3 礦質(zhì)元素指紋對(duì)粉葛產(chǎn)地鑒別分析

2.3.1 PCA分析 主成分分析屬于無(wú)監(jiān)督的模式，通過(guò)對(duì)變量進(jìn)行降維，篩選出數(shù)據(jù)集中的主要變異指標(biāo)。結(jié)果表明，前5個(gè)主成分累積方差貢獻(xiàn)率為80.08%。為便于直觀分析，選取前三個(gè)主成分得分繪制散點(diǎn)圖，其中第一主成分(PC1)可以解釋總方差變異的29.71%，第二主成分(PC2)涵蓋了16.34%的樣品信息，第三主成分(PC3)涵蓋了13.39%的樣品信息(圖1)。從載荷占比情況可知，第一主成分中Mn、Co、Sr、Cd、Cs、La、Ce、Pr、Nd、Sm和Ti載荷較大，與顯著性分析中陜西粉葛樣品信息相符；在第二主成分中Mg、Ca和Rb載荷較大，主要包含了湖北粉葛元素含量信息；第三主成分中P、K載荷較大，主要包含了廣西粉葛元素含量信息(表4)。因此，這3個(gè)地域粉葛礦質(zhì)元素分布呈現(xiàn)一定的規(guī)律特征。

表4 粉葛礦質(zhì)元素指紋前5個(gè)主成分中各變量的特征向量及累積方差貢獻(xiàn)率

圖1 不同地域粉葛礦質(zhì)元素含量前3個(gè)主成分得分散點(diǎn)圖

2.3.2 SLDA分析 為進(jìn)一步了解礦質(zhì)元素指紋對(duì)粉葛產(chǎn)地的判別效果，對(duì)粉葛中存在顯著性差異的20種礦質(zhì)元素進(jìn)行逐步判別分析，該判別函數(shù)采用回代檢驗(yàn)和交叉驗(yàn)證兩種方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，Mg、P、Co、Rb、Sr 5種元素被引入判別模型中，回代檢驗(yàn)和交叉驗(yàn)證整體判別率分別為97.7%和93.0%(表5)。利用兩個(gè)判別函數(shù)得分作圖，不同地域樣品具有其特有的空間分布，僅有3個(gè)樣品被錯(cuò)判(圖2)。

表5 不同地域粉葛逐步判別分析分類結(jié)果

圖2 不同地域粉葛樣品判別函數(shù)得分圖

2.3.3 HCA分析 為進(jìn)一步可視化各樣品經(jīng)判別后所屬分類，對(duì)其進(jìn)行了分層聚類分析。分層聚類分析使用平方歐式距離來(lái)識(shí)別和聚類樣本，屬于有監(jiān)督學(xué)習(xí)。由圖3可知，僅有廣西的1號(hào)樣品被錯(cuò)判給湖北，13號(hào)樣品被錯(cuò)判給陜西；湖北的7號(hào)樣品被錯(cuò)判給廣西；陜西的13樣品被錯(cuò)判給廣西?？梢?jiàn)，礦質(zhì)元素指紋結(jié)合聚類分析可有效實(shí)現(xiàn)對(duì)粉葛產(chǎn)地的區(qū)分。

圖3 不同地域粉葛礦質(zhì)元素含量的分層聚類分析

2.4 土壤對(duì)粉葛礦質(zhì)元素指紋的影響

由表6可知，陜西和廣西土壤中B、Na、Mg、P、Mn、Co、Zn、Sr、Mo、Ba存在顯著性差異，陜西和湖北土壤中Cu、Zn、Sr、Co含量存在顯著性差異，湖北和廣西土壤中Na、P、Mo含量存在顯著性差異(P<0.05)。為進(jìn)一步探索土壤中礦質(zhì)元素含量對(duì)粉葛中元素含量的影響，對(duì)粉葛和土壤中元素含量進(jìn)行Pearson相關(guān)分析。結(jié)果表明，粉葛與其相應(yīng)土壤中Rb、Sr、Ti元素含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，即粉葛樣品中Rb、Sr和Ti含量隨土壤元素含量的升高而增加。

表6 不同地域土壤礦質(zhì)元素含量差異性分析

表6(續(xù))

3 討論

不同地域粉葛中礦質(zhì)元素含量存在差異主要是受其采樣點(diǎn)所處地質(zhì)帶的影響[14]。而地質(zhì)帶的不同導(dǎo)致土壤的多樣化，因此不同地域土壤性質(zhì)和土壤類型是造成粉葛元素含量差異的主要因素[11,14]。陜西省采樣點(diǎn)以棕壤和黃棕壤為主，湖北則以黃褐土和黃棕壤為主，廣西采樣點(diǎn)土壤類型屬于酸紫粘土。王潔[19]和盧勝[20]研究表明，不同土壤類型的濕度、pH值、質(zhì)地、腐殖質(zhì)等屬性不同，造成不同地域同一元素含量存在差異。本研究發(fā)現(xiàn)，不同地域粉葛中Mg、P、Co、Rb和Sr含量與其所在地域土壤中含量差異呈一致性。陜西粉葛中Co和Sr含量最高，廣西粉葛中P和Rb含量高于其余兩地。陜西和湖北粉葛中Mg含量無(wú)顯著差異，但均顯著高于廣西粉葛，其原因在于陜西和湖北采樣點(diǎn)地理位置相近。陜西粉葛中Co含量最高，可能與當(dāng)?shù)赝寥乐蠧o含量較高有關(guān)，Kabata-Pendias等[21]研究表明，土壤中Co的富集會(huì)導(dǎo)致植物中該元素含量增加。大量研究表明，Rb和Sr可作為多數(shù)植源性農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地溯源的有效指標(biāo)。Zhao等[13]研究表明，茶葉中Rb、Sr含量與土壤中相應(yīng)元素含量顯著相關(guān)，本研究也表明土壤中Rb和植物中Rb含量存在相關(guān)性。Nyholma等[22]研究表明酸性土壤會(huì)抑制鉀離子的吸收，促進(jìn)植物中Rb的吸收。Rb作為表征土壤年代信息的主要元素[23]，常被應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)地溯源。張龍等[23]研究表明Pb、Sr、Ba、Ga和V可作為杭白菊產(chǎn)地鑒別的特征指標(biāo)，典則判別分析中，采用交叉驗(yàn)證方法進(jìn)行驗(yàn)證，判別效果能達(dá)到97.1%。眾多實(shí)例表明，Sr元素可作為多數(shù)食品產(chǎn)地溯源的特征指標(biāo)，如Tsialtas等[24]發(fā)現(xiàn)Sr含量受土壤特性的影響，在具有較高交換性鈣和陽(yáng)離子交換能力的有機(jī)土壤中Sr含量顯著低于無(wú)機(jī)土壤。本研究篩選出的Rb和Sr元素與粉葛所在地域土壤密切相關(guān)，可作為粉葛產(chǎn)地溯源穩(wěn)定有效的指標(biāo)。

此外，根據(jù)Ariyama等[25]和Qian等[26]研究表明，不同地域施肥類型、農(nóng)藥等栽培措施也可能對(duì)粉葛中礦質(zhì)元素含量差異產(chǎn)生影響。廣西粉葛種植地主要以施加挪威復(fù)合肥為主，而陜西、湖北兩地以普通復(fù)合肥和農(nóng)家肥為主。不同地域粉葛中Mg、P元素的吸收還可能與施加肥料種類和含量有關(guān)，Hejcman等[27]研究表明，肥料中的P元素含量與農(nóng)產(chǎn)品中的P元素含量呈正相關(guān)。Qian等[26]研究表明，水稻中Co、Al和Ni元素含量受農(nóng)藥影響最大，故推測(cè)不同地域粉葛中Co含量差異還可能受農(nóng)藥的影響。

另一方面，不同地域溫濕度、光照、降水量等氣候條件的不同，也會(huì)導(dǎo)致植物中礦質(zhì)元素含量不同。廣西氣候濕潤(rùn)多雨，年降水量明顯高于陜西和湖北采樣點(diǎn)，致使不同地域土壤含水量存在差異，進(jìn)而影響植物對(duì)礦質(zhì)元素的吸收。

根據(jù)前人研究表明，基因型、年際、產(chǎn)地以及三因素之間的交互作用可能對(duì)不同地域粉葛礦質(zhì)元素含量也有一定的影響。Zhao等[28]和Liu等[29]采用模型試驗(yàn)通過(guò)多因素方差分析表明，基因型、年際、產(chǎn)地及其交互作用對(duì)小麥礦質(zhì)元素含量有影響。本研究篩選的鑒別粉葛產(chǎn)地的礦質(zhì)元素指標(biāo)與賀媛媛等[30]研究野葛產(chǎn)地鑒別的B、Mg、P、Se和Sr 5種元素指標(biāo)相比，Mg、P和Sr均被作為鑒別葛根產(chǎn)地的有效指標(biāo)，但其余兩種元素存在一定差異，可能是因?yàn)樯a(chǎn)方式的不同，本研究的葛根主要為人工栽培，而野葛生長(zhǎng)在野生環(huán)境下，受外界環(huán)境影響較大。

4 結(jié)論

本研究選用有監(jiān)督的判別分析和無(wú)監(jiān)督的聚類分析與礦質(zhì)元素指紋相結(jié)合，在一定程度上實(shí)現(xiàn)了不同產(chǎn)地粉葛樣品的分類。利用逐步判別分析篩選出Mg、P、Co、Rb和Sr 5種特征元素作為鑒別陜西、湖北和廣西粉葛樣品的有效指標(biāo)。其中，陜西粉葛中Co和Sr含量最高，廣西粉葛中P和Rb含量高于其余兩地，陜西和湖北粉葛中Mg含量無(wú)顯著差異，但顯著高于廣西粉葛。經(jīng)交叉驗(yàn)證整體正確判別率為93.0%，表明礦質(zhì)元素指紋分析對(duì)粉葛產(chǎn)地溯源具有可行性。后續(xù)研究可對(duì)不同年際、不同基因型粉葛樣品進(jìn)行分析，并進(jìn)一步擴(kuò)大樣本數(shù)量，建立穩(wěn)定有效的產(chǎn)地判別模型。