趙東曉 施新琴 董亞茹 耿 兵 孫景詩(shī) 婁齊年 王照紅 郭 光

(山東省蠶業(yè)研究所，山東 煙臺(tái) 264002)

桑樹(MorusalbaL.)屬?？?Moraceae)桑屬(MorusL.)桑種(MorusalbaL.)，是多年生落葉喬木或灌木。我國(guó)是世界上桑樹種質(zhì)資源最豐富的國(guó)家，也是蠶桑生產(chǎn)的發(fā)源地。桑樹是蠶桑產(chǎn)業(yè)的重要載體，也是重要的經(jīng)濟(jì)樹種。桑樹的根、莖、葉和果實(shí)(桑椹)均富含生物堿、黃酮、多酚、多糖等生物活性物質(zhì)及多種維生素和礦物質(zhì)，具有抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、降血糖、降血壓等功能，有非常重要的藥用價(jià)值[1-2]。此外，由于桑樹的根系發(fā)達(dá)，具有較強(qiáng)的抗?jié)?、抗旱、抗寒、耐貧瘠能力，可作為生態(tài)樹種用于防風(fēng)固沙和荒山礦山修復(fù)。

干旱是制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的非生物脅迫之一，也是造成作物減產(chǎn)最重要的環(huán)境因素[3]。我國(guó)是一個(gè)旱災(zāi)多發(fā)的國(guó)家，由旱災(zāi)造成的經(jīng)濟(jì)損失占?xì)庀鬄?zāi)害損失總量的50%[4]。隨著全球氣候變暖，干旱將以更高的頻率，更長(zhǎng)的持續(xù)時(shí)間以及更廣的波及范圍成為一種氣候常態(tài)。干旱也是影響桑樹生長(zhǎng)和產(chǎn)量的重要環(huán)境因素之一[2]。因此，開展桑樹抗干旱研究，提高桑樹的抗旱性，對(duì)蠶桑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和轉(zhuǎn)型具有重要意義。

核輻射誘變技術(shù)是一種有效的育種手段，輻射一方面可直接作用于植物細(xì)胞或組織，另一方面可作用于細(xì)胞內(nèi)的水分子，產(chǎn)生超氧陰離子、羥基自由基、單態(tài)氧、過氧化氫等活性氧物質(zhì)[5]，從而間接造成細(xì)胞損傷。60Co-γ射線穿透力強(qiáng)、成本低且效率高，是最經(jīng)濟(jì)、有效的誘變因子。60Co-γ射線照射可造成植物DNA片段缺失或移位，影響細(xì)胞內(nèi)生理生化反應(yīng)，改變?nèi)~綠體類囊體結(jié)構(gòu)，調(diào)控抗氧化系統(tǒng)，誘導(dǎo)次生代謝物質(zhì)積累等[6-8]，在較短周期內(nèi)實(shí)現(xiàn)品種改良和新品種繁育的目的。核輻射有一定的“刺激效應(yīng)”，即低劑量的輻射會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生刺激效應(yīng)，而高劑量的輻射會(huì)抑制或損害植物生長(zhǎng)[9]。不同植物、品種、組織對(duì)輻射的敏感性不同[10]。目前，已有不少研究表明一定劑量的60Co-γ輻射可刺激植物的生長(zhǎng)發(fā)育。40 Gy60Co-γ輻射處理庫(kù)爾勒香梨萌動(dòng)枝可提高果實(shí)品質(zhì)[11]；2～30 Gy60Co-γ 輻射可顯著促進(jìn)萵苣(Lactucasativavar. capitata)種子的萌發(fā)，促進(jìn)幼苗根和胚軸的生長(zhǎng)[12]；20 Gy60Co-γ輻射可刺激硬質(zhì)小麥(TriticumdurumDesf.)種子發(fā)根，促進(jìn)根和上胚軸的生長(zhǎng)[13]；低劑量60Co-γ輻射可提高三果木(TerminaliaarjunaRoxb.)種子萌發(fā)率、活力指數(shù)，刺激幼苗生長(zhǎng)[14]。此外，低劑量60Co-γ輻射還有助于提高植物抗逆性。150 Gy60Co-γ輻射可提高胡楊(Populaseuphratica)種子在NaCl脅迫下的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)[15]。Shereen等[16]研究發(fā)現(xiàn)低劑量60Co-γ輻射可提高水稻(OryzasativaL.)的抗鹽性；Moussa[17]發(fā)現(xiàn)一定劑量60Co-γ射線輻射大豆種子，可增強(qiáng)大豆植株的抗旱性，提高干旱脅迫下大豆的產(chǎn)量，最佳輻射劑量為20 Gy；李波等[18]認(rèn)為600 Gy60Co-γ輻射能有效提高NaCl脅迫下苜蓿葉片和根可溶性蛋白、脯氨酸等含量和過氧化物酶、多酚氧化酶的活性，以此提高苜蓿的抗鹽能力。適宜劑量60Co-γ輻射還可提高NaCl脅迫下海濱錦葵(Kosteletzkyavirginica)種子的發(fā)芽速度和整齊度[19]。

目前，關(guān)于60Co-γ輻射桑樹種子，及對(duì)其幼苗抗旱性以及干旱脅迫相關(guān)基因表達(dá)的研究鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)對(duì)桑樹種子進(jìn)行不同劑量60Co-γ輻射處理，用10%聚二醇(polyethylene glycol, PEG)溶液模擬干旱脅迫，探討不同劑量60Co-γ輻射對(duì)PEG脅迫下桑樹幼苗葉片和根質(zhì)膜相對(duì)透性、抗氧化酶活性、滲透調(diào)劑物質(zhì)及丙二醛(malonaldehyde, MDA)含量的影響，并檢測(cè)過氧化物酶基因POD1、超氧化物歧化酶基因sodC和脯氨酸合成關(guān)鍵酶—吡咯啉-5-羧酸合成酶基因P5CS的表達(dá)，以期闡明60Co-γ輻射對(duì)PEG脅迫下桑樹幼苗生長(zhǎng)的影響，為桑樹抗旱機(jī)制的研究及抗逆性育種提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與主要試劑

供試桑樹品種為桂優(yōu)12號(hào)，種子購(gòu)自廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣總站。在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院輻射中心進(jìn)行桑種子60Co-γ輻射處理，輻射劑量率為10 Gy·min-1，輻射劑量為0(CK)、100、200、300、400 Gy共5組。每個(gè)輻射劑量設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)2 000粒種子。

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化物酶(peroxidase，POD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、MDA、可溶性蛋白、脯氨酸測(cè)試試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。RNA提取采用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit，反轉(zhuǎn)錄采用PrimeScriptTM1stStrand cDNA Synthesis Kit，熒光定量PCR采用TB GreenTMPremixExTaqTM，以上試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司。熒光定量PCR引物由上海生物工程有限公司合成。其他試劑皆為分析純，均購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

UV-2550紫外分光光度計(jì)，日本SHIMADZU公司；TGL18M高速冷凍離心機(jī)，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；Multiskan FC自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Scientific公司；BIO-RAD CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 幼苗脅迫處理 輻射處理后的桑樹種子種植到長(zhǎng)10 cm、寬10 cm、深10 cm的營(yíng)養(yǎng)缽中，種植土為蛭石、沙土、營(yíng)養(yǎng)土體積比1∶1∶3，每盆播種桑種子10粒，四葉一心期定苗，每盆留苗4株。盆栽試驗(yàn)在植物培養(yǎng)室中進(jìn)行，培養(yǎng)條件為：光/暗16/8 h/d，光照強(qiáng)度為480 lx，溫度25℃。待幼苗生長(zhǎng)至2個(gè)月時(shí)，每個(gè)輻射劑量挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的桑樹幼苗，平均分成2組。其中1組為對(duì)照組，澆1/4 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，另1組為PEG處理組，澆10% PEG溶液(用1/4 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液配制)。對(duì)照組和PEG處理組每5 d澆灌一次，每個(gè)處理15盆苗。對(duì)不同處理的桑苗進(jìn)行編號(hào)，編號(hào)見表1。在PEG脅迫第10天采集各組桑苗的葉片和根用于生理生化指標(biāo)的測(cè)定，在PEG脅迫處理24 h采集各組桑苗的葉片和根用于相關(guān)基因表達(dá)量的檢測(cè)。

表1 不同處理的設(shè)置及編號(hào)

1.3.2 細(xì)胞質(zhì)膜相對(duì)透性的測(cè)定 細(xì)胞質(zhì)膜相對(duì)透性用相對(duì)電導(dǎo)率表示[20]。試管用去離子水沖洗3遍后烘干，加入20 mL去離子水，用雷磁DDS-307電導(dǎo)率儀(上海儀電科學(xué)儀器有限公司)測(cè)其初電導(dǎo)率，計(jì)為S0；將洗凈葉片和根系用去離子水沖洗2次，用吸水紙吸干組織表面水分，剪成大小一致的小段，每個(gè)處理準(zhǔn)確稱取0.2 g材料置于已測(cè)初電導(dǎo)率值的試管中，真空抽氣10 min，室溫振蕩1 h，測(cè)其浸泡液電導(dǎo)率，計(jì)為S1。然后將試管封口，沸水浴30 min，冷卻后搖勻，測(cè)定終電導(dǎo)率，計(jì)為S2。每個(gè)處理做3個(gè)重復(fù)，按照公式計(jì)算細(xì)胞質(zhì)膜相對(duì)透性：

細(xì)胞質(zhì)膜相對(duì)透性=(S1-S0)/(S2-S0)×100%。

1.3.3 抗氧化酶活性及MDA、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的測(cè)定 取桑樹幼苗葉片和根系鮮樣，用蒸餾水沖洗干凈，吸水紙擦干后用于POD、SOD、CAT活性，MDA、可溶性蛋白、脯氨酸含量的測(cè)定。

POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定；SOD活性采用氮藍(lán)四唑(nitro-blue tetrazolium,NBT)還原法測(cè)定；CAT活性采用過氧化氫分解反應(yīng)法測(cè)定；MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法測(cè)定；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定；脯氨酸含量采用酸性茚三酮法測(cè)定。具體檢測(cè)方法參照試劑盒說明書。

1.3.4POD1、sodC、P5CS基因表達(dá)量的檢測(cè) 采用熒光定量PCR法檢測(cè)不同處理桑樹幼苗葉片和根中POD1、sodC、P5CS基因的表達(dá)。采集各處理組的葉片和根樣品并提取總RNA，每個(gè)樣品取500 ng RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的POD1[21]、sodC[21]、P5CS[22]基因及內(nèi)參基因MaACT1[20]的序列合成引物，引物序列如表2所示。利用CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)BIO-RAD公司)，設(shè)置反應(yīng)體系為20 μL，其中cDNA模板2 μL，2×TB GreenPremixExTaq10 μL，10 μmol·L-1上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 7 μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)；95℃ 10 s，60℃ 30 s，變性DNA產(chǎn)物。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。根據(jù)測(cè)得的Ct值，采用2-ΔΔCt方法[23]比較各處理組桑樹的葉片和根中POD1、sodC、P5CS基因的表達(dá)量。

表2 用于檢測(cè)基因表達(dá)的引物

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理與作圖采用Microsoft Office Word 2007和Excel 2007軟件，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 20.0軟件。用單因素試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)不同處理的雜交桑幼苗試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 60Co-γ 輻射對(duì)PEG脅迫下桑樹幼苗質(zhì)膜相對(duì)透性及MDA含量的影響

2.1.160Co-γ 輻射對(duì)PEG脅迫下桑樹幼苗葉片和根質(zhì)膜相對(duì)透性的影響 由圖1可知，桑樹幼苗葉片和根的質(zhì)膜相對(duì)透性隨著輻射劑量的增加呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，均在200 Gy處理劑量下最低。正常培養(yǎng)條件(CK組)和PEG處理(P組)下，200 Gy葉片質(zhì)膜相對(duì)透性與未輻射組相比分別顯著下降了4.58和1.19個(gè)百分點(diǎn)，200 Gy處理根系分別下降4.96和7.46個(gè)百分點(diǎn)，其中PEG處理下達(dá)到顯著差異。輻射劑量高于200 Gy時(shí)，CK組和P組葉片和根質(zhì)膜相對(duì)透性均逐漸升高，在400 Gy劑量時(shí)最大。400 Gy劑量下CK組和P組葉片質(zhì)膜相對(duì)透性較未輻射組分別增加1.75和8.02個(gè)百分點(diǎn)，其中后者達(dá)到顯著差異；根中質(zhì)膜相對(duì)透性在400 Gy劑量下CK組和P組較未輻射組分別增加3.46和12.94個(gè)百分點(diǎn)，CK組無顯著差異，而P組差異顯著。說明一定劑量60Co-γ 輻射桑種后桑樹幼苗葉片和根系中質(zhì)膜的損傷恢復(fù)較好，在PEG處理后效果更顯著，但過高的劑量會(huì)加劇質(zhì)膜損傷。

注：同一組織中不同小寫字母表示在0.05 水平差異顯著。下同。

2.1.260Co-γ 輻射對(duì)PEG脅迫下桑樹幼苗葉片和根中MDA含量的影響 由圖2可知，隨著輻射劑量的增加，桑樹幼苗葉片和根中MDA含量先降低后升高，200 Gy劑量下MDA含量最低。與CK0組和P0組相比，CK200組和P200組葉片中MDA含量分別降低4.61%和34.58%，根中MDA含量分別降低11.26%和35.56%，均在PEG處理下達(dá)到顯著差異，CK組中差異不顯著，說明相對(duì)于正常環(huán)境，PEG處理下200 Gy60Co-γ 輻射桑種后幼苗葉片和根中MDA含量明顯降低，膜脂過氧化傷害程度較輕。當(dāng)輻射劑量高于200 Gy時(shí)，CK組和P組葉片和根中MDA含量均逐漸升高，在400 Gy劑量下達(dá)到最高。與未輻射組相比，400 Gy輻射下CK組和P組葉片中MDA含量分別升高10.99%和17.91%，根中MDA含量分別升高2.73%和22.21%，均在P組中差異顯著，CK組中差異不顯著，說明高劑量60Co-γ輻射可加劇膜脂過氧化，造成PEG脅迫下MDA的過量積累。

圖2 60Co-γ 輻射對(duì)PEG脅迫下桑樹幼苗葉片和根部MDA含量的影響

2.2 60Co-γ輻射對(duì)PEG脅迫下桑樹幼苗抗氧化酶活性的影響

由圖3-A可知，隨著輻射劑量的增加，桑樹幼苗葉片和根中SOD活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在200 Gy劑量下活性最高。200 Gy輻射下，CK組和P組葉片SOD活性分別比未輻射組升高4.49%和22.88%，根系SOD活性分別比未輻射組升高6.76%和21.05%，其中CK組中變化不顯著，而PEG處理下顯著升高。當(dāng)輻射劑量大于200 Gy時(shí)，CK組和P組葉片和根系SOD活性低于未輻射組，且輻射劑量越大SOD活性越低。400 Gy輻射下，CK組和P組葉片中SOD活性分別比未輻射組下降14.56%和21.78%，根中SOD活性分別比未輻射組下降3.47%和33.63%，均在P組中差異顯著，CK組中差異不顯著。

由圖3-B可知，與SOD活性相似，桑樹幼苗葉片和根中POD活性也隨輻射劑量增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，200 Gy劑量下POD活性達(dá)到峰值。200 Gy輻射時(shí)，與未輻射組相比，CK組和P組葉片POD活性分別升高18.09%和33.78%，根系POD活性分別升高16.16%和27.54%，其中在CK組中無顯著變化，而在P組中變化顯著。300、400 Gy輻射時(shí)，CK組和P組葉片和根系POD活性低于未輻射組，400 Gy輻射時(shí)最低。400 Gy輻射下，與未輻射組相比，CK組和P組葉片中POD活性分別下降12.05%和31.34%，根中POD活性分別下降13.61%和26.00%，均在P組中顯著，CK組中不顯著。

由圖3-C可知，桑樹幼苗葉片和根中CAT活性變化規(guī)律與SOD、POD活性一致，輻射劑量在200 Gy以下時(shí)CAT活性逐漸升高，在輻射劑量為200 Gy時(shí)達(dá)到最高，輻射劑量高于300 Gy時(shí)CAT活性逐漸降低。200 Gy輻射時(shí)，與未輻射組相比，CK組和P組葉片CAT活性分別提高12.26%和22.68%，根系POD活性分別提高1.28%和48.12%，其中在CK組中變化不顯著，而在P組中變化顯著。400 Gy輻射時(shí)，CK組和P組葉片和根系CAT活性最低，與未輻射組相比，400 Gy輻射下CK組和P組葉片中CAT活性分別下降13.84%和34.61%，CK組差異不顯著，而P組差異顯著；根中CAT活性分別下降31.30%和19.29%，差異均顯著。

圖3 60Co-γ 輻射對(duì)PEG脅迫下桑樹幼苗葉片和根部SOD(A)、POD(B)和CAT(C)活性的影響

2.3 60Co-γ 輻射對(duì)PEG脅迫下桑樹幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

由圖4-A可知，100、200 Gy60Co-γ輻射可促進(jìn)可溶性蛋白在桑樹幼苗葉片和根中積累，300、400 Gy60Co-γ輻射則抑制了葉片和根中可溶性蛋白的積累。正常生長(zhǎng)條件下，100、200 Gy輻射后葉片可溶性蛋白含量分別較CK0增加2.70%和4.51%，300、400 Gy輻射后葉片可溶性蛋白含量分別較CK0下降1.49%和6.39%，但各輻射劑量與CK0組相比均無顯著變化。PEG處理下，100、200 Gy輻射后葉片可溶性蛋白含量分別較P0增加5.94%和16.60%，300、400 Gy輻射后葉片可溶性蛋白含量分別較P0下降7.69%和13.55%，其中200、300、400 Gy與P0的差異性均顯著。根中可溶性蛋白含量的變化趨勢(shì)與葉片相同，正常生長(zhǎng)條件下，100、200 Gy輻射下根中可溶性蛋白含量分別較CK0增加了2.54%和10.52%，300、400 Gy輻射下根中可溶性蛋白含量分別較CK0下降3.50%和9.07%，其中200、400 Gy劑量與CK0差異顯著。PEG處理下，100、200 Gy輻射下根中可溶性蛋白含量分別較P0增加0.76%和17.13%，300、400 Gy輻射下根中可溶性蛋白含量分別較P0下降1.08%和4.93%，其中200 Gy與P0的可溶性蛋白含量差異顯著。

由圖4-B可知，脯氨酸在桑樹幼苗葉片和根中的含量隨輻射劑量的增加表現(xiàn)出先升高后降低的變化規(guī)律。正常生長(zhǎng)條件下100、200 Gy輻射后葉片中脯氨酸含量分別較CK0組增加2.91%和11.07%，300、400 Gy輻射后葉片脯氨酸含量分別較CK0組下降0.99%和3.03%，差異均不顯著。PEG處理下，100、200 Gy輻射后葉片脯氨酸含量分別較P0組增加8.04%和14.75%，300、400 Gy輻射后葉片脯氨酸含量分別較P0組下降7.55%和20.67%，其中200和400 Gy與P0組的差異性均顯著。根中脯氨酸含量的變化趨勢(shì)與葉片相同，正常生長(zhǎng)條件下，100、200 Gy輻射下根中脯氨酸含量分別比CK0組增加了8.85%和17.35%，300、400 Gy輻射下根中脯氨酸含量分別比CK0組下降4.67%和12.21%。PEG處理下，100、200 Gy輻射下根中脯氨酸含量分別比P0組增加2.46%和27.56%，300、400 Gy輻射下根中脯氨酸含量分別比P0組下降9.61%和20.80%，其中200 Gy劑量與P0組差異顯著。

圖4 60Co-γ 輻射對(duì)PEG脅迫下桑樹幼苗葉片和根部可溶性蛋白(A)和脯氨酸(B)含量的影響

2.4 60Co-γ 輻射對(duì)PEG脅迫下桑樹幼苗脅迫相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖5-A可知，在正常生長(zhǎng)條件下，與CK0組相比，400 Gy以下60Co-γ 輻射對(duì)桑樹葉片和根中過氧化物酶基因POD1表達(dá)量無顯著影響。P0組葉片和根中POD1表達(dá)量分別比CK0組顯著升高了5.69倍和4.25倍。PEG處理下，100、200 Gy輻射下葉片POD1表達(dá)量分別是P0組的1.90倍和2.71倍，300、400 Gy輻射下葉片POD1表達(dá)量分別是P0組的0.91倍和0.60倍，其中100、200、400 Gy組達(dá)到顯著差異。PEG處理下，100、200 Gy輻射下根中POD1表達(dá)量分別是P0組的1.23倍和2.10倍，300、400 Gy輻射下根中POD1表達(dá)量分別是P0組的0.86倍和0.53倍，其中200、400 Gy組達(dá)到顯著差異。上述結(jié)果表明，100、200 Gy輻射可刺激葉片和根中POD1表達(dá)，而300、400 Gy則抑制了POD1表達(dá)。

由圖5-B可知，正常生長(zhǎng)條件下，與CK0組相比，100～400 Gy60Co-γ輻射對(duì)桑樹葉片和根中超氧化物歧化酶基因sodC表達(dá)量無顯著的影響。未輻射時(shí)，與CK0組相比PEG處理顯著上調(diào)葉片和根中sodC的表達(dá)，其中葉片中上調(diào)了2.09倍，根中上調(diào)了5.20倍。PEG處理下，與P0組相比，葉片sodC表達(dá)量在100、200 Gy輻射下上調(diào)1.78倍和5.17倍，300、400 Gy輻射處理下調(diào)了35.51%和74.61%，各輻射劑量均達(dá)到顯著差異。PEG處理下，與P0組相比，根中sodC表達(dá)量在100、200 Gy輻射下分別上調(diào)了1.40倍和2.81倍，300、400 Gy輻射下下調(diào)了9.58%和36.75%，其中100、200、400 Gy組之間達(dá)到顯著差異。

由圖5-C可知，正常生長(zhǎng)條件下， 與CK0組相比，吡咯啉-5-羧酸合成酶基因P5CS表達(dá)量在各輻射劑量下無顯著變化。與CK組相比PEG處理可顯著刺激葉片和根中P5CS表達(dá)，其中葉片中上調(diào)6.70倍，根中上調(diào)5.93倍。PEG處理下，100、200 Gy輻射下葉片P5CS表達(dá)量是P0組的1.80倍和2.24倍，300、400 Gy輻射下葉片P5CS表達(dá)量是P0組的0.90倍和0.56倍，其中100、200、400 Gy組達(dá)到了顯著差異。PEG處理下，100、200 Gy輻射下P5CS在根中的表達(dá)量是P0組的1.21倍和1.63倍，300、400 Gy輻射下P5CS在根中的表達(dá)量是P0組的0.82倍和0.28倍，各輻射組均達(dá)到顯著差異。

圖5 60Co-γ輻射對(duì)PEG脅迫下桑樹幼苗葉片和根部POD1(A)、sodC(B)和P5CS(C)基因表達(dá)水平的影響

3 討論

植物固著生長(zhǎng)的特性決定其只能被動(dòng)遭受逆境的影響和制約。植物為了適應(yīng)逆境，會(huì)通過改變形態(tài)特征和生理生化特性等方式來抵御逆境脅迫。PEG脅迫會(huì)損傷植物細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，使細(xì)胞膜透性增大、電解質(zhì)滲露，使細(xì)胞膜發(fā)生膜脂過氧化作用，從而在細(xì)胞中積累大量MDA[24]。本研究中，100和200 Gy60Co-γ 輻射桑種后，正常生長(zhǎng)環(huán)境中桑樹幼苗葉片和根質(zhì)膜相對(duì)透性和MDA含量較低，說明適當(dāng)劑量的60Co-γ 輻射會(huì)刺激桑樹幼苗細(xì)胞代謝活性，減輕膜脂過氧化，維持質(zhì)膜的完整性。300和400 Gy60Co-γ 輻射使桑樹幼苗葉片和根質(zhì)膜相對(duì)透性和MDA含量升高，說明輻射劑量超過一定閾值時(shí)會(huì)加速桑樹幼苗膜脂過氧化，并破壞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，Helaly等[25]在檸檬中也得到了類似的結(jié)果。PEG脅迫下，100～400 Gy60Co-γ 輻射對(duì)桑樹幼苗葉片和根部質(zhì)膜相對(duì)透性和MDA含量的影響與正常生長(zhǎng)條件下變化一致，但更明顯，說明低劑量的60Co-γ 輻射可在一定程度上維持PEG脅迫下桑樹幼苗細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，而高劑量輻射加劇了細(xì)胞膜的損傷，這與60Co-γ 輻射對(duì)擬南芥[26]在鹽脅迫下的作用結(jié)果一致，這可能是因?yàn)檫m當(dāng)劑量的60Co-γ 輻射能直接或間接激活某些膜脂過氧化過程中基因的表達(dá)。

逆境脅迫植物細(xì)胞中活性氧(reactive oxyen species, ROS)的積累會(huì)使膜脂過氧化，破壞細(xì)胞的生理和代謝。SOD、POD、CAT等抗氧化酶可清除過多的ROS，維持細(xì)胞內(nèi)活性氧的動(dòng)態(tài)平衡。本試驗(yàn)中，200 Gy60Co-γ 輻射的桑樹幼苗在PEG脅迫下，葉片和根中SOD、POD、CAT活性相比未輻射處理幼苗顯著升高，但輻射劑量達(dá)到400 Gy時(shí)葉片和根中SOD、POD、CAT活性相比未輻射處理幼苗顯著下降，表明200 Gy60Co-γ 輻射可通過提升SOD、POD、CAT活性來增強(qiáng)桑樹幼苗的抗旱性，但400 Gy輻射劑量過高，造成部分酶蛋白結(jié)構(gòu)改變從而導(dǎo)致酶失活，加劇了桑樹幼苗的傷害。這與擬南芥[26]、水稻[27]、無芒雀麥[28]中的研究結(jié)果一致。植物對(duì)逆境脅迫環(huán)境的適應(yīng)過程由眾多基因參與，并形成復(fù)雜的響應(yīng)機(jī)制。熒光定量PCR結(jié)果顯示，PEG脅迫下200 Gy60Co-γ 輻射可顯著激發(fā)POD1、sodC的表達(dá)，400 Gy則抑制了POD1、sodC的表達(dá)，這可能是抗氧化酶活性發(fā)生變化的原因。

植物受PEG脅迫時(shí)，細(xì)胞中積累一定量的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(如可溶性蛋白、脯氨酸等)，維持細(xì)胞滲透勢(shì)，抵御PEG脅迫帶來的滲透壓。因此，在一定程度的逆境脅迫下，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的多少可表示植物遭受逆境脅迫的強(qiáng)弱[29]。本研究結(jié)果表明，200 Gy60Co-γ 輻射下，PEG處理后桑樹幼苗葉片和根中可溶性蛋白和脯氨酸含量較未輻射處理顯著升高，且脯氨酸合成途徑中的關(guān)鍵限速酶基因P5CS的表達(dá)水平也顯著提高，脯氨酸在細(xì)胞中的積累可維護(hù)脅迫下保護(hù)酶的活性，穩(wěn)定生物膜和生物大分子結(jié)構(gòu)[30]，因此推測(cè)200 Gy60Co-γ 輻射增強(qiáng)桑樹幼苗抗旱性部分原因是由于誘導(dǎo)脯氨酸合成關(guān)鍵基因表達(dá)，從而促進(jìn)脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累。輻射劑量達(dá)到400 Gy時(shí)，可溶性蛋白和脯氨酸含量下降，P5CS的表達(dá)水平也受到顯著抑制，與大麥[31]、苜蓿[18]、烏拉爾甘草[32]的研究結(jié)果一致，可能是由于過高劑量的60Co-γ輻射抑制蛋白合成，或破壞蛋白結(jié)構(gòu)而造成蛋白降解，具體原因還需進(jìn)一步研究。下一步將深入分析提高桑樹抗旱性的精確輻射劑量區(qū)間，以及緩解不同程度PEG脅迫損傷的最佳輻射劑量區(qū)間，并探究輻射緩解PEG脅迫的具體機(jī)理。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，適宜劑量60Co-γ 輻射可以有效緩解10% PEG對(duì)桑樹幼苗造成的傷害，降低葉片和根中MDA含量和質(zhì)膜相對(duì)透性，減輕細(xì)胞膜脂損傷，提高SOD、POD、CAT抗氧化酶活性，促進(jìn)可溶性蛋白、脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累，上調(diào)POD1、sodC、P5CS的相對(duì)表達(dá)量，增強(qiáng)桑樹幼苗的抗旱性，其中以200 Gy60Co-γ 輻射的種子抗旱性最強(qiáng)。本研究結(jié)果為干旱地區(qū)桑樹種植栽培及坑旱性育種提供了一定的理論依據(jù)。