秦曉杰，王園媛，樊佳奇，李堯

（昆明文理學(xué)院城市學(xué)院，云南昆明 650222）

冬美人（Pachyphytum pachyphytoides）是景天科厚車蓮屬的多肉植物，是風(fēng)車草屬與厚葉草屬的跨屬雜交品種[1]，具有美麗的外觀和頑強的生命力，其植株漂亮深受大家的喜愛。另外，還有部分多肉由于基因的突變和被異常調(diào)控，會直接造成葉綠素缺失或某種物質(zhì)的增多或減少，使植物體的花、莖、葉甚至子房等部位發(fā)生顏色上的改變，葉片表現(xiàn)出黃化或白化等現(xiàn)象，稱之為“錦化”。

相比綠色植物來說，錦化植物顏色種類更多，觀賞價值更高，也更受歡迎。多肉植物的錦化現(xiàn)象很常見，但不宜培育。以60Co-γ 射線誘變導(dǎo)致植物體細(xì)胞變異是一種常見的育種手段[2]，該方法在多肉植物品種改良中日漸得到重視。葉色突變體通常由葉綠素合成或降解過程或細(xì)胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生重大變化而導(dǎo)致[3-4]。以多肉植物冬美人60Co-γ 射線誘變得到的白綠色葉片為試驗材料，測定了正常綠葉、白綠葉2 種不同類型葉片的葉綠素含量，并觀察比較了2 種葉片的顯微結(jié)構(gòu)。對進一步研究多肉植物射線誘變育種的穩(wěn)定性和多肉植物射線誘變育種的廣泛性提供一定理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究材料

以冬美人輻射育種獲得的白綠葉植株為試材，該葉色在扦插繁殖過程獲得白綠色植株[5]（見圖1）。

圖1 試驗用冬美人

2.2 研究方法

2.2.1 葉綠素含量測定。采用721 分光光度計分別用665nm 和649nm 的分光波長密度檢測得到2 種葉片葉綠素濾液光密度。95%的乙醇溶液對照，每組試驗重復(fù)3 次，分析試驗數(shù)據(jù)。計算后得出葉綠素a、b 的含量及葉綠素a/b 的比率。

2.2.2 石蠟切片制作。以多肉植物冬美人白綠色和綠葉為材料，將冬美人組織塊放入FAA 固定液中固定；經(jīng)洗滌、脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋，最后手動切片至4μm。在Olympus-CX21 光學(xué)顯微鏡下觀察和拍攝冬美人葉片結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片顯微結(jié)構(gòu)觀察

將制作好的石蠟切片放在Olympus-CX21 光學(xué)顯微鏡上觀察。其中，顯微結(jié)構(gòu)觀察所用的是冬美人白綠葉葉片白綠交替部分和綠葉材料綠色的部位（結(jié)果見圖2）。

圖2 冬美人葉片顯微結(jié)構(gòu)（左：白綠葉右：綠色葉）

2.1.1 白綠色葉的顯微結(jié)構(gòu)。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，白綠色葉葉片表皮細(xì)胞排列整齊，無明顯的柵欄組織。海綿組織排列有序，白綠葉的海綿組織兼有綠葉的海綿組織結(jié)構(gòu)特征，但白綠葉的海綿組織有部分缺失（如圖2 左圖箭頭所示位置）。海綿組織葉綠體數(shù)量較少，加之部分海綿組織缺失，所以白綠色葉片白色部分較正常綠色葉顏色淺。

2.1.2 綠色葉的顯微結(jié)構(gòu)。從圖2 右綠色葉可以看出，綠色葉有類似于柵欄組織的結(jié)構(gòu)，但是“柵欄組織”細(xì)胞排列沒有直觀認(rèn)識得那么整齊。海綿組織排列緊密，無缺失。綠色葉表皮細(xì)胞葉綠體比白綠色葉多且排列整齊，這也能解釋為何正常綠色葉葉片要比白綠色葉片顏色要深。所以，白綠色葉顏色差異可能是由于葉片中葉綠體數(shù)量及色素含量不同導(dǎo)致，特別是缺失海綿組織導(dǎo)致葉綠體數(shù)量減少。

2.1.3 顯微鏡結(jié)構(gòu)分析比較。觀察冬美人葉片顯微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)冬美人2 種不同類型葉片中柵欄組織都不太明顯，其綠葉切片中著色較深的是表皮細(xì)胞，推測引起這種顏色變化的原因可能是綠葉葉片中含有較多的葉綠體或色素，同樣觀察到綠葉的海綿組織排布情況整齊，且沒有發(fā)生缺失現(xiàn)象。相對而言，白綠葉中的海綿組織兼有綠葉海綿組織的結(jié)構(gòu)，但是白綠葉海綿組織白色部分有部分缺失。白綠葉葉片中葉綠體依舊存在一定數(shù)量，但綠色部分相對較少。因此，推測白綠色葉片海綿組織白色部分的缺失可能導(dǎo)致葉綠體數(shù)量減少，進一步導(dǎo)致白綠色葉葉色顯現(xiàn)出白綠相間的條紋差異。

2.2 不同類型葉片的葉綠素含量測定結(jié)果及分析

結(jié)果如表1 所示，通過對比所得到不同類型葉片的葉綠素含量和葉綠素a/b 值進行方差分析。

表1 不同類型葉片的葉綠素含量和a/b 值

根據(jù)不同類型葉片的葉綠素含量結(jié)果分析可知，白綠葉與綠葉相比，白綠葉葉片中葉綠素a 含量和葉綠素b 含量比正常綠葉中葉綠素a 和葉綠素b 含量低。同時，白綠葉葉片中葉綠素b 含量最低。根據(jù)試驗結(jié)果進行分析比較發(fā)現(xiàn)，白綠葉葉片葉綠素的變化情況與常青山等[3]學(xué)者對菊花黃綠葉突變體不同類型葉片的葉綠素含量測定結(jié)果具有一致性。白綠葉葉片中的葉綠素與綠葉的葉綠素相對比為22.13%，根據(jù)表1數(shù)據(jù)可知，白綠葉的葉綠素a 含量是綠葉的29.11%，葉綠素b 含量是綠葉的9.30%，白綠葉葉綠素a 的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于葉綠素b 的含量。突變體白綠葉葉綠素a/b 是綠色葉葉綠素a/b 含量的3.5 倍。根據(jù)上述分析表明：白綠葉和綠葉2 種不同類型葉片的葉綠素a、葉綠素b 和總?cè)~綠素含量差異顯著。

3 討論與結(jié)語

3.1 討論

葉綠素減少的植株突變[6]有可能是葉綠素缺乏和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化導(dǎo)致的。如大豆總?cè)~綠素缺乏突變體，大米、大麥、油菜和其他葉綠素b 缺乏突變體。葉綠素b缺乏突變可能會受到Mg 螯合酶的影響，這導(dǎo)致葉綠素b 合成較少[3]。

本試驗研究發(fā)現(xiàn)，白綠葉葉片海綿組織綠色部分與綠葉的海綿組織相似。也觀察到白綠葉海綿組織白色條紋部分缺失，白綠葉中葉綠素含量顯著低于綠葉中的葉綠素含量，導(dǎo)致葉片出現(xiàn)白色條紋，推測白綠葉突變可能是由于基因突變導(dǎo)致缺失海綿組織，從而導(dǎo)致白綠葉葉片中葉綠素含量低。不同類型葉片中葉綠素含量測定表明：白綠葉和綠葉之間葉綠素a 含量、葉綠素b 含量及總?cè)~綠素含量存在明顯差異，其中白綠葉中葉綠素b 含量最低[7]。綠色葉片葉綠素a/b 含量低于白綠葉，這意味著突變白葉葉綠素b 含量比葉綠素a減少很多，因此，突變可能屬于葉綠素b 含量不足的突變體。說明冬美人白綠葉葉片上白綠相間顏色的差異可能是白綠葉葉片中白色部分海綿組織缺失導(dǎo)致葉綠素含量的不同所致，使其外觀呈現(xiàn)出白綠相間的條紋。

3.2 結(jié)語

分析了冬美人葉片顯微結(jié)構(gòu)和葉片的葉綠素含量測定結(jié)果兩個方面，發(fā)現(xiàn)冬美人白綠葉中的葉綠素含量明顯低于綠葉中的葉綠素含量，而白綠葉中葉綠素a含量低于綠葉中葉綠素a 含量，葉綠素b 含量遠(yuǎn)低于綠葉葉片，白綠葉的葉綠素a/b 值大于綠葉葉片，可能是白綠葉的葉綠素b 減少幅度大于葉綠素a 所致[8-9]，但還需通過試驗進一步驗證。從顯微結(jié)構(gòu)來看，柵欄組織在冬美人綠葉和白綠葉均不明顯。白綠葉葉片中綠色部分海綿組織和綠葉的海綿組織相似，但是白色部分缺失海綿組織。至于白綠葉白色部分的海綿組織缺失是否是由于基因突變所致，有待于進一步研究。