王逸博，孫海鷹

（中國藥科大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)系，江蘇省藥物分子設(shè)計與成藥性優(yōu)化重點實驗室，江蘇 南京 210009）

1 凋亡抑制蛋白的結(jié)構(gòu)與功能

凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins，IAPs）是一類高度保守的內(nèi)源性抑制細胞凋亡的蛋白家族，在昆蟲、酵母和哺乳動物等中廣泛存在[1]。目前在人體中發(fā)現(xiàn)的IAPs共有8種，包括NIAP、c-IAP1、c-IAP2、XIAP、Survivin、BRUCE、MLIAP和ILP2[2]。IAPs蛋白家族的結(jié)構(gòu)特征是氮端含有1 ～ 3個包含70個氨基酸的桿狀病毒IAP重復(fù)序列（baculoviral IAP repeat，BIR)，即BIR結(jié)構(gòu)域。BIR結(jié)構(gòu)域是絕大多數(shù)IAPs的抗凋亡活性所必須的，不同BIR結(jié)構(gòu)域具有一定的同源性，但功能卻各不相同[3]。IAPs主要通過直接或間接地抑制半胱天冬酶（Caspases）的活性或參與調(diào)節(jié)核因子κB（NF-κB）的功能來抑制細胞凋亡，抑制IAPs可以誘導(dǎo)細胞凋亡或增加細胞死亡的閾值[4]。在IAPs中被研究最多的是XIAP、c-IAP1和c-IAP2，它們均含有3個BIR結(jié)構(gòu)域（見圖1）。XIAP的BIR3結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合并抑制Caspase-9，而XIAP的BIR2結(jié)構(gòu)域和BIR1與BIR2之間的肽鏈可以結(jié)合并抑制 Caspase-3和 Caspase-7[5]。c-IAP1和 c-IAP2也可以通過它們的BIR3結(jié)構(gòu)域與Caspase-9結(jié)合，但不能抑制Caspase-9的活性，它們主要通過抑制Caspase-8的激活來抑制細胞凋亡的發(fā)生[6-8]。XIAP、c-IAP1和c-IAP2在很多腫瘤中過度表達，而且其過度表達與腫瘤的發(fā)展和抗藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)，因此它們被認為是研發(fā)新型抗腫瘤藥物的 靶點[9-12]。

2 Smac的功能及其與IAPs的相互作用

Smac是線粒體接收到凋亡信號后釋放出的一種蛋白，它是細胞中IAPs的內(nèi)在調(diào)節(jié)劑。Smac可以通過其氮端的四肽AVPI（Ala-Val-Pro-Ile）與IAPs的BIR結(jié)構(gòu)域結(jié)合，因此Smac氮端的四肽AVPI被稱為IAP結(jié)合單元（IAP binding motif，IBM）。當Smac與XIAP結(jié)合時先形成二聚體，二聚體中的2個AVPI四肽單元分別與XIAP的BIR2和BIR3結(jié)合。Smac與XIAP的結(jié)合可以直接抑制XIAP與Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9的結(jié)合，從而恢復(fù)Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9的功能，促使凋亡發(fā)生。當Smac與c-IAP1和c-IAP2結(jié)合時只與這2種IAPs的BIR3結(jié)合。Smac與c-IAP1和c-IAP2結(jié)合后會誘導(dǎo)它們降解，從而間接促使Caspase-8的激活[9-12]。

目前已有多個以XIAP、c-IAP1和c-IAP2為靶點的小分子IAPs抑制劑進入臨床研究，其中大部分都是以四肽AVPI為先導(dǎo)化合物設(shè)計的BIR3選擇性泛IAPs抑制劑，即這些化合物可以與XIAP、c-IAP1和c-IAP2的BIR3結(jié)構(gòu)域有效結(jié)合[13]。另外，基于BIR3選擇性IAPs抑制劑已有很多報道，其中部分化合物已經(jīng)進入臨床研究[13-14]。對BIR2選擇性IAPs抑制劑的研究相對較少，但近年來隨著對IAPs作用機制的深入研究，對BIR2選擇性IAPs抑制劑的研究也引起了越來越多藥物化學(xué)家們的關(guān)注。BIR2選擇性IAPs抑制劑可以阻斷XIAP與Caspase-3和Caspase-7 的相互作用，但不會使c-IAP1和c-IAP2 降解，也不會引起因c-IAP1和c-IAP2降解導(dǎo)致的非經(jīng)典NF-κB通路的激活，其功能與BIR3選擇性IAPs抑制劑完全不同，因此是一類新型的IAPs抑制劑，不僅可以作為藥物進行研發(fā)，也可以作為小分子工具用于相關(guān)的生物學(xué)機制研究。

3 BIR2選擇性IAPs抑制劑

3.1 早期通過高通量篩選得到的BIR2選擇性IAPs抑制劑

對BIR2選擇性的XIAP抑制劑的研究最早可追溯至2003年。Tamm等[15]利用噬菌體展示技術(shù)發(fā)現(xiàn)一個通過二硫鍵環(huán)合的六肽CEFESC（Cys-Glu-Phe-Glu-Ser-Cys）可以特異性地與XIAP的BIR2結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，但跟其他IAPs沒有結(jié)合作用。Caspase-3和Caspase-7可抑制該六肽CEFESC與XIAP的結(jié)合，但Caspase-8不具備該功能，表明該六肽是靶向XIAP中與Caspase-3和Caspase-7結(jié)合的區(qū)域，但該六肽與XIAP的具體結(jié)合模式尚不清楚。

2003年Wu等[16]通過高通量篩選的方法對一個包含160 000個小分子化合物的化合物庫進行了篩選，成功發(fā)現(xiàn)了一系列非肽類的小分子磺酰胺類化合物，這類化合物通過與XIAP中的linker-BIR2區(qū)域結(jié)合，競爭性地解除XIAP對Caspase-3的抑制作用，其中化合物1結(jié)合的IC50為10 μmol·L-1。這類化合物可以誘導(dǎo)293細胞系的凋亡，并且增強CD95和腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（TNF related apoptosis inducing ligand，TRAIL）誘導(dǎo)凋亡的能力。

2004年Shimmer等[17]通過對包含近1×108個肽類及非肽類化合物的化合物庫進行高通量篩選，發(fā)現(xiàn)了一系列多苯基脲類BIR2選擇性XIAP抑制劑，其中活性最強的是化合物2。該化合物可以特異性與XIAP的BIR2結(jié)構(gòu)域結(jié)合并恢復(fù)Caspase-3的活性，而且可以直接誘導(dǎo)多種腫瘤細胞凋亡。在異種移植的小鼠模型中該化合物可以抑制腫瘤組織的生長并增加腫瘤對化療藥物的敏感性。

3.2 以多肽為先導(dǎo)化合物設(shè)計的BIR2選擇性IAPs抑制劑

雖然以往研究中通過高通量篩選發(fā)現(xiàn)了一些BIR2選擇性XIAP抑制劑，但這些化合物與XIAP-BIR2的結(jié)合能力通常不強，而且結(jié)合模式也不確定，因此多個課題組采用與BIR3選擇性IAPs抑制劑的研發(fā)中類似的方式，以Smac氮端的四肽AVPI為先導(dǎo)化合物，對BIR2選擇性IAPs抑制劑進行研究。

四肽AVPI既可以與XIAP的BIR2結(jié)構(gòu)域結(jié)合，也可以與XIAP的BIR3結(jié)構(gòu)域結(jié)合，但它與BIR3的結(jié)合能力強于與BIR2的結(jié)合能力。2006年Sweeney等[18]用不同的天然氨基酸對AVPI中各個位置的氨基酸分別進行替換，合成了一系列四肽，并研究了四肽與XIAP的BIR2結(jié)構(gòu)域結(jié)合的構(gòu)效關(guān)系。結(jié)果表明，為了保持與XIAP-BIR2的結(jié)合能力，P1位置只能選Ala；P2位置傾向于β位帶有支鏈的疏水性氨基酸，如Val、Thr、Ile等，或者是既含有疏水性，又含有親水性片段的氨基酸，如Gln、Glu、Lys、Arg、Tyr等；P3位置傾向于含有小的側(cè)鏈的氨基酸，如Ala、Ser、Val等；P4位置也傾向于帶有較小側(cè)鏈的氨基酸，如Gly、Ala、Thr、Val等。

2013年Lukacs等[19]對Sweeney等[18]的研究結(jié)果進行了確證，發(fā)現(xiàn)與BIR2結(jié)合能力最強且選擇性最高的四肽是ATAA（Ala-Thr-Ala-Ala），該四肽ATAA與XIAP的BIR2結(jié)合的抑制常數(shù)Ki為1.7 μmol·L-1，比 Smac 氮 端 的 四肽 AVPI與 XIAP 的BIR2 的結(jié)合能力強 3 倍（Ki= 5.2 μmol·L-1）。更重要的是，Lukacs等[19]還解析了5個四肽與XIAP的BIR2形成的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，分別是ATAA 復(fù)合物（PDB ID：4j45）、AIAV 復(fù)合物（PDB ID：4j44）、AVPI 復(fù)合物（PDB ID：4j46）、SVPI 復(fù)合 物（PDB ID：4j47） 和AMRV 復(fù) 合 物（PDB ID：4j48），從而從結(jié)構(gòu)生物學(xué)的角度證實了這些四肽與XIAP的BIR2結(jié)構(gòu)域的結(jié)合模式。雖然這些四肽與XIAP-BIR2的結(jié)合能力有差異，但它們與XIAP-BIR2的結(jié)合模式基本一致。比較AVPI與XIAP-BIR2和XIAP-BIR3形成的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn)，BIR2和BIR3中3個關(guān)鍵位置的氨基酸殘基的不同顯著影響了它們與四肽的結(jié)合，這3個位置的氨基酸殘基分別是His223/Trp323、Phe224/Tyr324和Lys206+Lys208/Gly306+Thr308（見圖2）。四肽中P3位置的氨基酸殘基可以與His223/Trp323和Phe224/Tyr324結(jié)合。His223中的側(cè)鏈比Trp323中的側(cè)鏈小，因此BIR2與四肽中P3位置的氨基酸殘基的疏水性作用弱于BIR3。同樣因為His223中的側(cè)鏈小于Trp323，His323與Phe224之間的空腔比Trp223與Tyr324間的空腔大，而且Tyr324中的羥基可以與BIR3中的Gly306的羰基形成氫鍵，使蛋白構(gòu)象具有更強的剛性，所以與BIR2結(jié)合時四肽的P3位置可以是較大的不同基團，而與BIR3結(jié)合時P3位置只能是Pro。在XIAP-BIR2中Lys206和Lys208的側(cè)鏈及其下方的Gln197的側(cè)鏈形成了一個較淺的口袋與四肽中P4位置的氨基酸殘基的側(cè)鏈結(jié)合，而在XIAP-BIR3中對應(yīng)于Lys206和Lys208的分別是Gly306和Thr308，這2個殘基與P4位置的氨基酸側(cè)鏈結(jié)合較弱，P4位置的氨基酸側(cè)鏈主要是與其下方由Lys297、Lys299及Leu292形成的一個較大的疏水性口袋結(jié)合，因此XIAP-BIR3中與P4位置結(jié)合的疏水性空腔較大，可以容納較大的疏水性氨基酸側(cè)鏈。這些結(jié)構(gòu)信息為設(shè)計選擇性IAPs抑制劑奠定了基礎(chǔ)。

圖2 AVPI與XIAP-BIR2（A）和XIAP-BIR3（B）的結(jié)合模式[19]Figure 2 Binding modes of AVPI with XIAP-BIR2 (A)and XIAP-BIR3 (B)

2011年Cosford課題組發(fā)現(xiàn)將AVPI四肽中的Ile殘基用芳基取代可以提高化合物對BIR2的結(jié)合能力，其中選擇性最高的化合物3與XIAP的BIR2結(jié) 合 的Ki為 0.74 μmol·L-1，是該 化合物與 XIAP的 BIR3 結(jié)合能力的 7 倍（Ki= 5.5 μmol·L-1）[20]。Cosford課題組在這類化合物中用氮甲基丙氨酸替換了AVPI中的Ala，因為以前在BIR3選擇性的化合物的研究中發(fā)現(xiàn)在Ala的氨基上引入甲基不會影響化合物的蛋白結(jié)合能力，但可以顯著提高化合物的抑制腫瘤細胞生長的能力，可能是因為引入甲基后可以提高細胞穿透性。細胞活性研究表明，這類化合物在乳腺癌MDA-MB-231細胞系中可以增強TRAIL引起凋亡的能力。在上述研究的基礎(chǔ)上，Cosford課題組對該類化合物的構(gòu)效關(guān)系進行了進一步的探索，發(fā)現(xiàn)用Ala替換Pro可以進一步地提高選擇性，其中選擇性最優(yōu)的化合物4與XIAP的BIR2的結(jié)合能力是其與XIAP的BIR3的結(jié)合能力的 70 倍（Ki：0.64 μmol·L-1vs40.15 μmol·L-1）；與化合物3類似，化合物4單一給藥并未顯示出抑制腫瘤細胞生長的能力，但同樣能使細胞對TRAIL誘導(dǎo)的凋亡更加敏感[21]。

2014年羅氏公司公開了2項擬肽類的BIR2選擇性IAPs抑制劑的專利，發(fā)現(xiàn)用芳環(huán)與AVPI衍生物中Pro的五元環(huán)并環(huán)后可以顯著提高化合物與BIR2的結(jié)合能力和選擇性，其中代表性的化合物5與XIAPBIR2 和 XIAP-BIR3 結(jié)合的 IC50分別為 0.013 μmol·L-1和大于 55 μmol·L-1，化合物 6 與 XIAP- BIR2 和XIAP-BIR3 結(jié)合的 IC50分別為 0.010 μmol·L-1和大于55 μmol·L-1[22-23]。這些結(jié)果進一步證明了以四肽為先導(dǎo)化合物研發(fā)BIR2選擇性IAPs抑制劑的可行性。

3.3 經(jīng)過高通量篩選并優(yōu)化得到的新型BIR2選擇性IAPs抑制劑

2013年Andrew課題組報道了一類新型的苯并西平類和苯并二氮雜?類BIR2選擇性IAPs抑制劑[24-25]。該課題組首先通過高通量篩選發(fā)現(xiàn)了一個具有一定的BIR2選擇性且相對分子質(zhì)量與親脂性均較低的化合物7，隨后以化合物7為先導(dǎo)化合物進行了詳細的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，合成了一系列BIR2選擇性小分子IAPs抑制劑，顯著提高了化合物的蛋白結(jié)合能力和選擇性，并改善了藥代動力學(xué)性質(zhì)，其中代表性的化合物8與XIAP-BIR2結(jié)合的IC50為 39 nmol·L-1，與 XIAP-BIR3 結(jié)合的 IC50為3.06 μmol·L-1。與其選擇性結(jié)合并抑制 XIAP-BIR2的活性一致，化合物8在體內(nèi)和體外均可以有效阻斷XIAP與Caspase-3和Caspase-7的相互作用，而且不會引起c-IAP1/2的降解，表明化合物8并不能與c-IAP1/2的BIR3結(jié)構(gòu)域有效結(jié)合。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，化合物8對細胞色素P4503A4酶（CYP3A4）具有很強的抑制作用（IC50= 1.8 μmol·L-1），因此不能用于進一步的臨床研究。為了進一步改善成藥性，該課題組在化合物8的基礎(chǔ)上進行了進一步廣泛且細致的優(yōu)化，在保持與XIAP-BIR2的結(jié)合能力及選擇性的同時，進一步改善了化合物的藥代動力學(xué)性質(zhì)，并顯著降低了化合物對CYP3A4的抑制，其中最優(yōu)的化合物9抑制XIAP-BIR2和XIAP-BIR3的Ki分別為45 nmol·L-1和 30.8 μmol·L-1?；衔?9 抑制 CYP3A4的 IC50是 16 μmol·L-1，與化合物 8 相比顯著降低。藥代動力學(xué)研究表明，化合物9具有良好的藥代動力學(xué)性質(zhì)和安全性，在體內(nèi)實驗中化合物9與DR5抗體conatumummab聯(lián)合用藥時可以有效增強Caspase-3和Caspase-7的活性。另外在機制研究中發(fā)現(xiàn)，化合物9在作用過程中沒有激活非經(jīng)典的NF-κB通路，表明該化合物不會有效抑制c-IAP1/2的活性。

4 結(jié)語與展望

細胞凋亡是癌癥的主要特征之一，在細胞凋亡中有重要功能的蛋白很多都是抗腫瘤新藥研發(fā)的重要靶點。IAPs是細胞凋亡中的逆向調(diào)節(jié)劑，已有多個靶向IAPs的BIR3結(jié)構(gòu)域的小分子化合物和基于BIR3選擇性IAPs抑制劑設(shè)計的二聚體IAPs抑制劑進入臨床研究。不同于廣受關(guān)注的BIR3選擇性IAPs抑制劑，BIR2選擇性IAPs抑制劑有其獨特的功能。BIR2選擇性IAPs抑制劑可以阻斷XIAP與Caspase-3和Caspase-7的相互作用，并促進多種抗腫瘤藥物的抗腫瘤效果，但不會引起c-IAP1和c-IAP2的降解，因此對BIR2選擇性IAPs抑制劑的作用機制進行研究，可以進一步闡明XIAP、c-IAP1和c-IAP2的生物學(xué)功能，并促進以IAPs為靶點的新藥研發(fā)。筆者所在課題組近年來一直在從事新型IAPs抑制劑的研發(fā)工作，近期工作集中于BIR2選擇性IAPs抑制劑的設(shè)計、合成及生物活性研究，并探索BIR2選擇性IAPs抑制劑的進一步利用。

在已報道的IAPs抑制劑中，最初研發(fā)二聚體IAPs抑制劑的目的是發(fā)展出能夠模擬二聚的Smac蛋白的功能，同時與XIAP的BIR2和BIR3更有效結(jié)合的XIAP抑制劑，但已報道的二聚體IAPs抑制劑實際上都是基于BIR3選擇性IAPs抑制劑設(shè)計的，利用BIR2選擇性的化合物與BIR3選擇性的化合物有可能設(shè)計出更有效的二聚體XIAP抑制劑。另外，已報道的二聚體IAPs抑制劑的抗腫瘤活性比BIR3選擇性的單體IAPs抑制劑強100倍以上，而它們與XIAP的結(jié)合能力也比單體IAPs抑制劑強100倍以上；但有研究表明，IAPs抑制劑的抗腫瘤活性并不依賴于對XIAP的抑制，對其具體作用機制尚不清楚。因此，通過設(shè)計BIR2選擇性IAPs抑制劑和BIR3選擇性IAPs抑制劑組成的新型二聚體IAPs抑制劑，有可能進一步闡明二聚體IAPs抑制劑的作用機制，而且可以促進二聚體IAPs抑制劑在新藥研發(fā)中的應(yīng)用。

近年來，對蛋白降解靶向嵌合體（PROTACs）的研究已成為藥物化學(xué)研究中的熱點之一。PROTACs是由與靶蛋白結(jié)合的配體和與E3泛素連接酶結(jié)合的配體通過連接鏈連接而成的一類嵌合分子，可以同時與靶蛋白和E3泛素連接酶結(jié)合，促進靶蛋白的泛素化，使靶蛋白被蛋白酶體降解。XIAP、c-IAP1和c-IAP2均具有E3泛素連接酶的功能，因此IAPs抑制劑可被用于PROTACs的研發(fā)，但BIR3選擇性IAPs抑制劑可以誘導(dǎo)c-IAP1和c-IAP2的快速降解，因此嚴重限制了它們在PROTACs研發(fā)中的利用。BIR2選擇性IAPs抑制劑不會引起c-IAP1和c-IAP2的降解，因此有可能在基于IAPs的PROTACs的研發(fā)中得到應(yīng)用。

最后，選擇性地作用于cIAP1和cIAP2的小分子化合物已有報道，但選擇性地作用于XIAP的小分子化合物一直未能發(fā)現(xiàn)。以前的研究結(jié)果表明，BIR2選擇性IAPs抑制劑對XIAP-BIR2有較高的選擇性，因此有可能利用對XIAP-BIR2有較高選擇性的化合物設(shè)計選擇性降解XIAP的PROTACs，從而實現(xiàn)對XIAP的選擇性抑制。這類化合物在闡明不同的IAPs家族蛋白的生物學(xué)功能方面將會有廣泛的應(yīng)用。

綜上所述，BIR2選擇性IAPs抑制劑是一類新型的IAPs抑制劑，不僅可以用于以IAPs為靶點的新藥研發(fā)，而且可以用于IAPs的生物學(xué)作用機制的研究中。