李 娟，解文強(qiáng)，苑國(guó)民，周廷斌，彭學(xué)文

（唐山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，河北 唐山 063000）

平菇（Pleurotus ostreatus）培養(yǎng)料類型主要有生料、發(fā)酵料、熟料3種[1-3]，3種類型各有優(yōu)缺點(diǎn)。隨著近年來市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)加劇，錯(cuò)季（高溫季節(jié)）出菇越來越多，由于氣溫較高，環(huán)境雜菌基數(shù)大，發(fā)酵料或生料栽培菌袋污染率較高，因此常采用熟料栽培。過去平菇栽培戶通常采用成本較低的燃煤鍋爐滅菌，但隨著環(huán)境污染治理力度的持續(xù)加強(qiáng)，這種方式在多個(gè)省份被禁用，對(duì)微利的平菇行業(yè)來說無疑是雪上加霜。誘導(dǎo)滅菌是將培養(yǎng)料中的真菌孢子、細(xì)菌芽孢等休眠體誘導(dǎo)萌發(fā)成營(yíng)養(yǎng)體，然后再進(jìn)行高溫滅殺的一種滅菌方法[4]。此方法既具有熟料滅菌的優(yōu)勢(shì)，且滅菌成本低，是近年來行業(yè)內(nèi)逐漸采用的培養(yǎng)料處理方法。但培養(yǎng)料在誘導(dǎo)過程中pH、溫度、微生物種群變化以及滅菌效果等方面尚缺乏基本數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)原料

玉米芯、棉籽皮、麩皮、土豆、生石灰等均采購自市場(chǎng)；瓊脂購自石獅市環(huán)球瓊膠工業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)配方

微生物培養(yǎng)、滅菌效果檢驗(yàn)培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母膏5 g、NaCl 5 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.4；平菇培養(yǎng)料配方：玉米芯46.5%、棉籽殼46.5%、麩皮5%、生石灰2%，料水比 1∶1.4。

1.3 試驗(yàn)儀器

pH計(jì)，杭州齊威儀器有限公司；DIJITAL S菌落計(jì)數(shù)儀，西班牙J.P.SELECTA公司；HH-420水浴鍋，上海力辰邦西儀器科技有限公司；LCD-280S溫度計(jì)，常州市瑞明儀表廠；OSE-VX-01振蕩器，天根生化科技（北京）有限公司；移液器，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）股份公司；誘導(dǎo)裝置為鋼筋混凝土澆筑，外覆保溫層，下置通風(fēng)管道，外置離心空壓機(jī)、溫控儀等設(shè)備，可控制溫度。

1.4 誘導(dǎo)方法

原料按配方稱量、混合均勻后，置于誘導(dǎo)裝置內(nèi)，每2小時(shí)通氣10 min，誘導(dǎo)40 h。

1.5 細(xì)菌、真菌計(jì)數(shù)方法

平皿計(jì)數(shù)法。于誘導(dǎo)裝置內(nèi)隨機(jī)3點(diǎn)取樣，分別稱取原料樣品10 g于90 mL無菌水中，充分震蕩10 min，后吸取1 mL于9 mL無菌水中，充分震蕩5 min，稀釋至 10-9g·mL-1，選取 10-7g·mL-1、10-8g·mL-1、10-9g·mL-1（取樣時(shí)間不同，稀釋倍數(shù)略有調(diào)整）分別吸取0.1 mL涂布平皿，每個(gè)濃度3次重復(fù)，于26℃培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)。在誘導(dǎo)過程中每4小時(shí)取樣1次。

1.6 溫度、pH測(cè)定方法

將溫度計(jì)探頭預(yù)先埋入料堆內(nèi)，上下兩層布置。下層探頭距料堆底部20 cm，上層探頭距離底部40 cm。在誘導(dǎo)過程中每2小時(shí)記錄1次。

pH測(cè)量，上述1.5取樣后，稱取樣品10 g加入50 mL蒸餾水中，充分震蕩30 min，過濾后使用pH計(jì)測(cè)量濾液，在誘導(dǎo)過程中每4小時(shí)測(cè)量1次。

1.7 滅菌方法

依上述1.5取樣涂布平皿后，將剩余各樣品置于95℃水浴鍋中5 min，冷卻后吸取0.1 mL涂布平皿，每濃度3次重復(fù)，于26℃培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)。

誘導(dǎo)結(jié)束后的培養(yǎng)料攤涼、裝袋，100℃滅菌2 h，冷卻至30℃以下時(shí)接種平菇菌種。滅菌結(jié)束后培養(yǎng)料亦取樣計(jì)菌落數(shù)，方法同1.5。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度和pH變化情況

不同取樣時(shí)間原料誘導(dǎo)后原料的溫度和pH變化見圖1。

圖1 溫度、pH變化曲線圖Fig.1 The transformation of temperature and pH

由圖1所示，拌料后4 h（第2次取樣），溫度快速上升3.5℃，pH隨之下降，下降幅度較小，僅下降了0.06。隨后的16 h，即至第6次取樣，溫度快速上升，累計(jì)升溫16.8℃，每小時(shí)上升1.05℃。這一時(shí)期也是pH快速下降的時(shí)期，由6.92下降至6.39，共下降了0.53，每小時(shí)下降0.03。由此直至誘導(dǎo)結(jié)束合計(jì)20 h內(nèi)，溫度緩慢上升，總計(jì)上升3.9℃，每小時(shí)僅上升0.11℃，為第2階段的約1/10；pH先升后降，第9次取樣時(shí)pH明顯升高，8 h后達(dá)到整個(gè)誘導(dǎo)期的最低值6.07，直到誘導(dǎo)結(jié)束裝袋滅菌后再次測(cè)量，pH重新回升至6.48。

2.2 微生物數(shù)量變化情況

誘導(dǎo)過程中，微生物數(shù)量統(tǒng)計(jì)見表1。

表1 微生物數(shù)量記錄表Tab.1 The number of microorganisms

由表1可知，拌料開始至第3次取樣，耗時(shí)8 h左右，溫度顯著上升，從23.4℃上升到38.3℃，升溫9.9℃，pH下降0.19，細(xì)菌總數(shù)上升明顯，比拌料時(shí)增加了約5倍，達(dá)到3.900×1012個(gè)/g。滅菌后，細(xì)菌總數(shù)明顯下降，為2×108個(gè)/g。此時(shí)的細(xì)菌應(yīng)為營(yíng)養(yǎng)體和休眠體的混合物，休眠體可能包含尚未萌發(fā)的及萌發(fā)后再次生成。同一時(shí)期，真菌總數(shù)下降明顯，由最初的2.000×1012個(gè)/g減少為0.330×1012個(gè)/g，減少了約6倍。滅菌后總數(shù)維持在1×108個(gè)/g左右，休眠體萌發(fā)為營(yíng)養(yǎng)體后被殺滅較多。

第4次至第7次取樣耗時(shí)14 h，此期間溫度為38℃～45℃，上升了6℃，pH持續(xù)下降，下降幅度0.22，達(dá)到整體誘導(dǎo)期的次最低值6.39，較初始pH下降了0.59。此間細(xì)菌總數(shù)急劇上升，滅菌前細(xì)菌總數(shù)未測(cè)出，滅菌后的細(xì)菌總數(shù)與滅菌前相差較少，說明大部分細(xì)菌為營(yíng)養(yǎng)體。真菌總數(shù)繼續(xù)下降，直到第7次取樣不可測(cè)出。

第8次至第11次取樣耗時(shí)12 h，溫度持續(xù)上升，但上升速度減緩，只上升了2.2℃；pH則經(jīng)歷了先上升后急速下降的過程，第9次快速上升至6.86（接近初始值），至誘導(dǎo)結(jié)束又快速下降至整個(gè)誘導(dǎo)期的最低值6.07。細(xì)菌總數(shù)則持續(xù)攀升，尤其滅菌后的細(xì)菌數(shù)量大量增加，最高達(dá)2.88×1010個(gè)/g。溫度的升高、pH的下降，導(dǎo)致細(xì)菌大量產(chǎn)生休眠體，在95℃處理5 min的條件下顯然不能達(dá)到滅菌效果。但真菌數(shù)量則持續(xù)下降，滅菌后未測(cè)出。

綜上試驗(yàn)結(jié)果及真菌孢子、細(xì)菌芽孢的萌發(fā)條件可知，溫度在23℃～38℃，真菌孢子及細(xì)菌芽孢可大量萌發(fā)生長(zhǎng)；隨著溫度的升高（達(dá)到45℃時(shí)），細(xì)菌仍能大量繁殖，真菌則不再生長(zhǎng)；溫度持續(xù)升高，細(xì)菌產(chǎn)生芽孢，進(jìn)入休眠狀態(tài)。無論是大量繁殖還是進(jìn)入休眠狀態(tài)都不是理想狀態(tài)，所以誘導(dǎo)時(shí)溫度是關(guān)鍵因素。結(jié)合本文試驗(yàn)結(jié)果，誘導(dǎo)溫度宜控制在23℃～38℃。

2.3 滅菌結(jié)果

按照 ISO7218∶2007（E）[5]或國(guó)標(biāo) GB 4789.3-2016菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算[6]，樣品中均含有真菌或細(xì)菌，但總體數(shù)量均較低，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。

表2 100℃滅菌2 h不同稀釋倍數(shù)下菌落數(shù)統(tǒng)計(jì)Tab.2 Statistics of colony under different dilution times after sterilization by 100℃for 2 h

由表2可知，平菇培養(yǎng)料經(jīng)過誘導(dǎo)后，真菌數(shù)量明顯下降，滅活后連續(xù)6批未能檢出；誘導(dǎo)過程中細(xì)菌數(shù)量大幅度增加，但經(jīng)過100℃滅菌2 h后，僅有極微量的細(xì)菌存活。通過后續(xù)的接種、培養(yǎng)平菇菌種后，對(duì)平菇菌絲的生長(zhǎng)無影響。

3 結(jié)論與討論

平菇培養(yǎng)料經(jīng)過誘導(dǎo)處理后，pH經(jīng)歷了下降、升高、下降的變化過程，溫度先期上升幅度較大，后期啟動(dòng)誘導(dǎo)裝置制冷設(shè)備，阻止了溫度持續(xù)上升，上升幅度亦趨緩；真菌數(shù)量急劇下降（誘導(dǎo)至28 h時(shí)不可檢出），細(xì)菌總數(shù)持續(xù)大幅增加，最高達(dá)2.88×1010個(gè)/g。經(jīng)過100℃滅菌2 h后，pH升高，細(xì)菌、真菌等殺滅效果較好，接種后對(duì)平菇菌絲的生長(zhǎng)未有影響。

3.1 誘導(dǎo)時(shí)間

季節(jié)不同、外界溫度不同，誘導(dǎo)的起始溫度亦有差別。試驗(yàn)中起始溫度為23.4℃，至誘導(dǎo)結(jié)束總計(jì)40 h。誘導(dǎo)20 h時(shí)，細(xì)菌數(shù)量急劇增加[7-8]，此時(shí)真菌總數(shù)卻大幅下降，甚至不可檢出，pH也明顯下降；此時(shí)期培養(yǎng)料狀態(tài)與誘導(dǎo)結(jié)束時(shí)的情況類似，誘導(dǎo)是否完全還有待于進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

3.2 pH變化

整個(gè)誘導(dǎo)期間pH出現(xiàn)了下降、升高、下降的變化過程，第1次下降是由于細(xì)菌的大量繁殖，產(chǎn)生了大量的酸類物質(zhì)[9]，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)pH出現(xiàn)了上升的現(xiàn)象，可能是前期大量的酸類物質(zhì)被利用。從平皿觀察，pH上升前后菌落形態(tài)統(tǒng)計(jì)未有顯著區(qū)別。誘導(dǎo)過程中所產(chǎn)生的酸類物質(zhì)并未對(duì)平菇菌絲生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的副作用，這與長(zhǎng)期以來“拌料后盡快裝袋，避免產(chǎn)酸”觀點(diǎn)相悖，培養(yǎng)料發(fā)酵產(chǎn)酸導(dǎo)致pH下降對(duì)其菌絲生長(zhǎng)沒有影響。

3.3 真菌變化

隨著誘導(dǎo)的進(jìn)行真菌數(shù)量逐步減少，這與常路路[10]結(jié)論一致，但是究竟是減少（或失活）還是由于計(jì)數(shù)方法限制未能檢出還需要進(jìn)一步試驗(yàn)。誘導(dǎo)過程中細(xì)菌數(shù)量的急劇增加以及胞外分泌物的大量累積可能抑制了真菌孢子的萌發(fā)，或抑制了真菌菌絲片段的生長(zhǎng)，導(dǎo)致在平板計(jì)數(shù)中未出現(xiàn)可見真菌菌落。此次試驗(yàn)中放線菌未列為觀察對(duì)象，細(xì)菌種類也未進(jìn)行詳細(xì)鑒別，后續(xù)試驗(yàn)應(yīng)引入高通量或從分子生物學(xué)水平加強(qiáng)試驗(yàn)手段[11-14]，提高試驗(yàn)結(jié)果可靠性、準(zhǔn)確性。

由于平菇具有較廣泛的適應(yīng)性，生產(chǎn)中采用的培養(yǎng)料眾多，除棉籽殼、玉米芯外，棉桿、蔗糖渣、豆秸、木屑等[15-18]均用于栽培平菇。采用誘導(dǎo)法處理培養(yǎng)料還需根據(jù)季節(jié)、原料（基礎(chǔ)微生物不同）通風(fēng)（進(jìn)風(fēng)）溫度等的不同靈活掌握誘導(dǎo)時(shí)間。本次試驗(yàn)中棉籽皮、玉米芯混合培養(yǎng)料，混合培養(yǎng)料初始溫度23℃，誘導(dǎo)40 h后，100℃滅菌2 h可用于平菇栽培。