陰祖旺，李明亮，毛雙雙，葛 雪，史文峰，鄭紅麗，劉有旺

（山東第一醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，山東 泰安 271000）

免疫性血小板減少性紫癜（immune thrombocytopenic purpura，ITP）是臨床常見(jiàn)的出血性疾病，一般表現(xiàn)為皮膚、黏膜自發(fā)性出血，血小板減少，出血時(shí)間延長(zhǎng)。目前臨床通常采用輸血、輸入血小板并聯(lián)合采用潑尼松激素和環(huán)磷酰胺治療[1]。但輸注血小板存在感染血源性疾病的風(fēng)險(xiǎn)，反復(fù)輸血或血小板使機(jī)體誘發(fā)同種異體免疫反應(yīng)，產(chǎn)生溶血反應(yīng)或破壞輸注的血小板等。激素及免疫抑制劑長(zhǎng)期使用副作用大且有一定的復(fù)發(fā)率。中藥治療免疫性血小板減少性紫癜是目前的發(fā)展趨勢(shì)和研究熱點(diǎn)。泰山紫草是泰山名藥之一，有活血、涼血、清熱解毒等功效[2-4]，但該藥材對(duì)免疫性血小板減少性紫癜的作用及機(jī)制尚不清楚。本研究擬探究泰山紫草對(duì)ITP 的治療效果及機(jī)制，旨在為臨床治療免疫性血小板減少性紫癜提供治療選擇。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康8 周齡雄性BALB/c 小鼠，60只，鼠齡8 周齡，體重18～22 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。健康雄性Hartley Guinea Pig 豚鼠，6 只，6 周齡，體重300～400 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。本研究經(jīng)山東第一醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2 儀器與方法 試劑弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，小鼠IL-2 和IL-10ELISA 試劑盒購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司，小鼠血小板生成素ELISA 試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物，F(xiàn)ITC Anti-MouseCD41 抗體購(gòu)自美國(guó)Biolegend 公司，泰山紫草購(gòu)自泰安市泰山四大名藥開(kāi)發(fā)有限公司，醋酸潑尼松龍注射液購(gòu)自華中藥業(yè)股份有限公司。本研究用到的主要儀器有酶標(biāo)儀（賽默飛世爾，Multiskan FC）、離心機(jī)（美國(guó)Sigma 公司，3-16L）；血細(xì)胞分析儀（日本光電公司，MEK6318K）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司，F(xiàn)ACS Aria II）。

1.3 方法

1.3.1 血清制備 麻醉小鼠，眼眶采血，EDTA 抗凝，1000 rpm 離心10 min，取富含血小板的上清，3000 rpm離心10 min，棄上清，沉淀用PBS 洗3 次，用生理鹽水配成1×109個(gè)/ml 血小板懸液，與等量弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑乳化混勻制備豚鼠抗小鼠血小板血清（Guinea pig anti-mouse platelet serum，APS）。第1 周給豚鼠皮下注射含弗氏完全佐劑的血小板懸液1 ml，然后連續(xù)4 周每周皮下注射含弗氏不完全佐劑佐劑的血小板懸液1 ml，第6 周心臟采集豚鼠全血，3000 rpm 離心10 min，取上清，此即為豚鼠抗小鼠血小板血清。經(jīng)腹腔注射血小板，隔30 d 進(jìn)行2 次注射后分離豚鼠血清備用。

1.3.2 模型建立 將上述制備的豚鼠抗小鼠血小板血清用生理鹽水以1∶4 稀釋?zhuān)籼旄骨蛔⑸銪ALB/c 小鼠，每只每次100 μl，共19 d 建立免疫性血小板減少性紫癜（ITP）模型。

1.3.3 動(dòng)物分組及給藥 于造模后第7 天開(kāi)始分組給藥。將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、泰山紫草湯低、中、高劑量組和激素組，每組10 只。正常對(duì)照組小鼠不作任何處理，泰山紫草湯低、中、高劑量組于造模后給予自制泰山紫草湯，其中低、中高3 個(gè)劑量的用量分別為5 mg/20 g、10 mg/20 g、20 mg/20 g，激素組于造模后給予醋酸潑尼松龍治療0.4 mg/20 g，模型組于造模后給予等體積蒸餾水。各組均灌胃給藥，1 次/d，共給藥14 d。

1.3.4 指標(biāo)檢測(cè) 小鼠眼眶取血，EDTA-Na2 溶液抗凝。血細(xì)胞分析儀檢測(cè)外周血中血小板數(shù)量。5 μl抗凝血加50 μl TO 工作液和5 μl CD41-FITC 抗體，室溫避光孵育15 min 后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)網(wǎng)織血小板比例。吸取每只小鼠100 μl 血清樣品，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）分別測(cè)定血清中IL-2、IL-10 和血小板生成素（thrombopoietin，TPO）含量。ELISA 操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用（）表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 泰山紫草對(duì)ITP 模型小鼠外周血血小板計(jì)數(shù)和外周血網(wǎng)織血小板比例的影響 模型組外周血血小板數(shù)低于正常對(duì)照組，網(wǎng)織血小板比例高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；激素組血小板數(shù)高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；泰山紫草湯低、中、高劑量組血小板數(shù)高于模型組，且呈劑量依賴(lài)效應(yīng)（P＜0.05），且與正常對(duì)照組接近；泰山紫草湯低、中、高劑量組網(wǎng)織血小板比例均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；泰山紫草湯低、中、高劑量組網(wǎng)織血小板比例和激素組接近，無(wú)明顯差異（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 泰山紫草對(duì)ITP 小鼠外周血小板計(jì)數(shù)和對(duì)網(wǎng)織血小板百分比的影響（）

表1 泰山紫草對(duì)ITP 小鼠外周血小板計(jì)數(shù)和對(duì)網(wǎng)織血小板百分比的影響（）

注：與正常對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

2.2 泰山紫草對(duì)ITP 模型小鼠骨髓細(xì)胞IL-2、IL-10、TPO 含量的影響 模型組血清IL-2 水平高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；泰山紫草湯低、中、高劑量組和激素組IL-2 水平均明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；泰山紫草湯低、中、高劑量組IL-2 水平與激素組水平接近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；模型組血清IL-10 含量低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；泰山紫草湯低、中、高劑量組IL-10 水平高于模型組和激素組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組小鼠血清TPO 含量高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；泰山紫草湯低、中、高劑量組TPO 水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；泰山紫草湯低、中、高劑量組TPO 水平與激素組水平接近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 泰山紫草對(duì)ITP 小鼠外周血中IL-2、IL-10、TPO 的影響（，pg/ml）

表2 泰山紫草對(duì)ITP 小鼠外周血中IL-2、IL-10、TPO 的影響（，pg/ml）

注：與正常對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與激素組比較，cP＜0.05

3 討論

ITP 是與感染、藥物、遺傳等多種原因有關(guān)的自身免疫異常引起的疾病[5]。泰山紫草對(duì)ITP 的療效及作用機(jī)制尚不十分清楚。本研究建立了ITP 小鼠模型，通過(guò)泰山紫草湯灌胃治療，發(fā)現(xiàn)泰山紫草湯能有效提高外周血血小板數(shù)量，改善血小板減少的癥狀，降低血小板代償性增殖程度。表明泰山紫草湯對(duì)ITP 有治療作用。

研究顯示，體內(nèi)細(xì)胞因子失調(diào)在ITP 發(fā)病過(guò)程中起著重要的作用[6-8]。細(xì)胞因子可調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的類(lèi)型，參與人體的炎癥和免疫反應(yīng)。在ITP 患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞因子的水平異常，如白細(xì)胞介素（Interleukin，IL）-2、IL-10 和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）等[8，9]。其中IL-2 主要是由Th1 細(xì)胞分泌的一種促炎性細(xì)胞因子，可以促進(jìn)T細(xì)胞增殖，并促使B 細(xì)胞增殖、分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生大量抗血小板抗體，進(jìn)而導(dǎo)致血小板減少[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，泰山紫草湯可以降低ITP 模型小鼠體內(nèi)IL-2含量，療效接近醋酸波尼松龍，推測(cè)其具有抑制T細(xì)胞的增殖、分化及B 細(xì)胞生成血小板抗體，減少血小板免疫性破壞、從而達(dá)到提高血小板數(shù)量的作用。細(xì)胞因子IL-10 主要由Th2 細(xì)胞分泌，并能抑制Th1 細(xì)胞分泌的一種抑炎性細(xì)胞因子[11]。本研究表明泰山紫草湯可以升高ITP 模型小鼠體內(nèi)IL-10 含量，療效優(yōu)于醋酸波尼松龍。推測(cè)其可能抑制B 細(xì)胞產(chǎn)生大量抗血小板抗體，進(jìn)而引起血小板增加。綜合對(duì)泰山紫草湯對(duì)IL-2 的抑制作用和對(duì)IL-10的促進(jìn)作用，推測(cè)泰山紫草湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)促炎性細(xì)胞因子和抑炎性細(xì)胞因子的平衡，進(jìn)而調(diào)節(jié)抗血小板抗體的產(chǎn)生，最終達(dá)到治療ITP 的作用。本研究結(jié)果也與相關(guān)研究報(bào)道相一致[6，7]。

TPO 是與血小板數(shù)量和抗血小板抗體最密切相關(guān)的指標(biāo)[12，13]。TPO 泰山紫草治療后與模型對(duì)照組比較，各用藥組TPO 水平均降低，表明泰山紫草湯能明顯降低ITP 模型小鼠體內(nèi)TPO 濃度，推測(cè)抗血小板抗體減少后，血小板升高，進(jìn)而促進(jìn)了外周血中TPO 的攝取、利用和降解，使血清TPO 濃度下降，與相關(guān)研究報(bào)道相一致[9，12，13]。

盡管本研究取得初步結(jié)果，但由于實(shí)驗(yàn)條件限制，未系統(tǒng)研究多種促炎性細(xì)胞因子和抗炎性細(xì)胞因子的變化及其與抗血小板抗體之間的直接聯(lián)系，在以后的工作中，將深入研究泰山紫草湯的免疫作用機(jī)制?？傊?，本實(shí)驗(yàn)為ITP 在新藥研制方面提供理論依據(jù)，為ITP 治療提供新思路。