張 冰，徐 欣

PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄輔激活物 (transcriptional coactivator with PDZ-binding motif, Taz)是Hippo信號(hào)通路下游重要的效應(yīng)因子，作為一個(gè)包含WW結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄共激活因子，其在哺乳動(dòng)物的多種組織器官發(fā)育中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[1-3]。Taz可以通過(guò)上調(diào)Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 (Runt-related transcription factor 2,Runx2)，激活Smad信號(hào)通路及骨鈣蛋白的表達(dá)，此外，Taz與14-3-3蛋白相互作用可以調(diào)控干細(xì)胞的分化[4]。上述研究提示Taz可能在骨生成或者某些硬組織形成過(guò)程中起重要作用。Runx2是成骨細(xì)胞分化過(guò)程中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子[5-6]，參與調(diào)控骨和牙齒的發(fā)育及牙齒的礦化[7-8]。有研究發(fā)現(xiàn)Runx2與Taz在促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的過(guò)程中存在相互作用關(guān)系[9]，但在牙齒發(fā)育中二者是否具有相關(guān)性尚不明確。本研究采用免疫組織化學(xué)的方法觀察Taz、Runx2在大鼠下頜第一磨牙發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)，以明確其時(shí)空特異性表達(dá)規(guī)律，為深入探究二者在牙齒發(fā)育中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Wistar大鼠(10周齡)(山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，Taz多克隆抗體(Santa Cruz公司，美國(guó))，Runx2多克隆抗體(Abcam公司，美國(guó))，免疫組織化學(xué)SABC二抗試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，其余所需試劑及設(shè)備均由山東省口腔組織再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 獲取標(biāo)本 10周齡Wistar大鼠(由山東大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)經(jīng)山東大學(xué)口腔醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，倫理審批號(hào)：GD202036)雌雄2∶1交配，次日檢栓，發(fā)現(xiàn)陰栓視為受孕，當(dāng)天中午即為受孕0.5 d。分別取胎齡14.5(E14.5)、E16.5、E18.5天大鼠胚胎頭顱標(biāo)本(各4例)及出生后0(PN0)、PN3及PN7、PN14、PN21、PN28天大鼠下頜骨標(biāo)本(各4例)，4 ℃條件下常規(guī)組織固定24 h(4%多聚甲醛，pH=7.2)、脫鈣(10% EDTA，pH=7.2)、脫水(梯度乙醇)及石蠟包埋。大鼠胚胎頭顱標(biāo)本行冠狀面5 μm石蠟連續(xù)切片，大鼠下頜骨標(biāo)本行矢狀面5 μm石蠟連續(xù)切片。經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色及免疫組織化學(xué)染色分別從形態(tài)學(xué)上觀察磨牙的發(fā)育狀況，從蛋白水平上檢測(cè)Taz、Runx2的表達(dá)。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片二甲苯脫蠟3次(10 min/次)，梯度乙醇下行水化處理，磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01 mol/L，pH=7.2)漂洗3次(5 min/次)，0.1%胰酶37 ℃孵育10 min進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS漂洗3次，3%過(guò)氧化氫37 ℃孵育20 min，以阻斷內(nèi)源性的過(guò)氧化氫酶。正常山羊血清封閉30 min后去除多余血清勿漂洗，滴加Taz抗體(1∶300)或Runx2抗體(1∶400)濕盒內(nèi)4 ℃條件下過(guò)夜。次日，切片于室溫下復(fù)溫30 min，PBS漂洗3次，滴加生物素標(biāo)記二抗，37 ℃孵育25 min，PBS漂洗3次，滴加酶結(jié)合物，37 ℃孵育25 min，PBS漂洗3次，由顯微鏡下控制DAB顯色。免疫組織化學(xué)蘇木素復(fù)染，梯度乙醇上行脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。陰性對(duì)照采用PBS代替Taz、Runx2抗體4 ℃過(guò)夜，其余條件相同。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色

牙齒的發(fā)育始于口腔上皮的增厚，E14.5天時(shí)牙板向間充質(zhì)細(xì)胞中內(nèi)陷形成花蕾狀(圖1)。隨著細(xì)胞進(jìn)一步增殖、分化，E16.5天時(shí)成釉器分化為3層細(xì)胞即內(nèi)釉上皮層、外釉上皮層和星網(wǎng)狀層，此期成釉器為帽狀期(圖1)。釉結(jié)作為一個(gè)臨時(shí)性的結(jié)構(gòu)呈密集的細(xì)胞團(tuán)狀，參與多種信號(hào)的表達(dá)調(diào)控，在牙齒形態(tài)的發(fā)生中起關(guān)鍵作用。在PN7天可見雙層結(jié)構(gòu)的上皮根鞘，上皮根鞘開始向根方增殖、延伸啟動(dòng)了牙根發(fā)育的形態(tài)學(xué)信號(hào)(圖2)。PN14至PN28天，由牙囊的間充質(zhì)細(xì)胞分化而形成的牙骨質(zhì)、牙周膜、牙槽骨等結(jié)構(gòu)完成了牙周組織的發(fā)育，根尖孔逐漸縮窄，牙根的發(fā)育逐步完成(圖2)。

2.2 Taz、Runx2在胚胎期大鼠下頜第一磨牙牙胚中的表達(dá)與定位

在E14.5天即蕾狀期， Taz在口腔上皮及其周圍的間充質(zhì)細(xì)胞中均有陽(yáng)性表達(dá)，Runx2在蕾狀期表達(dá)廣泛(圖1)。在E16.5天，隨著牙胚的發(fā)育成釉器形狀似帽子，在釉結(jié)、牙乳頭及牙囊部分細(xì)胞中都存在Taz、Runx2的陽(yáng)性表達(dá)，此外，Taz在口腔上皮中仍呈陽(yáng)性著色(圖1)。至E18.5天的鐘狀早期，Taz的陽(yáng)性表達(dá)主要集中于內(nèi)釉上皮層、外釉上皮層、中間層及牙囊處，在牙乳頭及星網(wǎng)狀層中的表達(dá)較弱，而Runx2的表達(dá)在鐘狀早期則主要集中于內(nèi)釉上皮層、中間層、牙乳頭及牙囊中(圖1)。

2.3 Taz、Runx2在出生后大鼠下頜第一磨牙發(fā)育中的表達(dá)與定位

當(dāng)牙胚發(fā)育至PN7天時(shí)，牙冠的發(fā)育即將完成，在成釉細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞層、牙本質(zhì)基質(zhì)、中間層及上皮根鞘中存在Taz及Runx2的陽(yáng)性表達(dá)， 此期成牙本質(zhì)細(xì)胞在牙尖部位為高柱狀，向根尖方向逐漸呈現(xiàn)扁平狀(圖2)。至PN14天時(shí)，牙冠的發(fā)育已經(jīng)完成，在成釉細(xì)胞層中Taz的表達(dá)逐漸減弱；在此期的成牙本質(zhì)細(xì)胞、牙本質(zhì)小管及上皮根鞘處仍可見到Taz與Runx2兩種蛋白的陽(yáng)性表達(dá)(圖2)。在牙齒發(fā)育至PN21及PN28天時(shí)，在近牙冠處的成牙本質(zhì)細(xì)胞中Taz的表達(dá)較強(qiáng)，向根尖方向表達(dá)逐漸減弱，在根部成牙本質(zhì)細(xì)胞及牙本質(zhì)基質(zhì)中Taz的表達(dá)呈弱陽(yáng)性(圖2)。Runx2在成牙本質(zhì)細(xì)胞及牙本質(zhì)小管中表達(dá)呈陽(yáng)性。牙周膜即牙周韌帶，是牙周組織中起支持作用的重要結(jié)構(gòu)，為連接牙骨質(zhì)和牙槽骨的結(jié)締組織，在PN21及PN28天的免疫組織化學(xué)染色中發(fā)現(xiàn)Taz、Runx2在牙周膜及牙槽骨中也存在陽(yáng)性著色(圖2)。

eo: 成釉器; me: 間充質(zhì)細(xì)胞; ek: 釉結(jié); oee: 外釉上皮層; dp: 牙乳頭; iee: 內(nèi)釉上皮層; df: 牙囊； oe: 外釉上皮

3 討 論

牙齒的發(fā)育是一個(gè)連續(xù)、復(fù)雜的上皮與間充質(zhì)相互作用的過(guò)程，許多信號(hào)分子參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及牙齒形態(tài)的發(fā)生[10-12]，轉(zhuǎn)錄共激活因子Taz是一個(gè)14-3-3結(jié)合蛋白[2,13]，為Yap的旁系同源蛋白，二者在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上有45%的相似性[2]。研究發(fā)現(xiàn)Yap/Taz是Hippo信號(hào)通路下游重要的效應(yīng)因子，參與多種組織器官發(fā)育，二者在間充質(zhì)干細(xì)胞的分化中也發(fā)揮重要作用[3]。有研究報(bào)道在小鼠正常切牙發(fā)育過(guò)程中Yap參與調(diào)控干細(xì)胞的增殖及分化[14]，此外，Yap過(guò)表達(dá)可以影響細(xì)胞極性及牙齒形態(tài)的發(fā)生[15]。作為Yap的同源蛋白，Taz在牙齒發(fā)育過(guò)程的調(diào)控作用及機(jī)制目前報(bào)道尚不多見。Runx2是成骨細(xì)胞標(biāo)記基因(例如骨橋蛋白、骨涎蛋白、骨鈣蛋白等)的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因子，為Runt家族的一員，具有高度保守的DNA結(jié)構(gòu)域。研究發(fā)現(xiàn)Runx2不僅參與成骨細(xì)胞分化和骨形成的過(guò)程，同時(shí)在牙胚形成、牙齒礦化及牙周組織的發(fā)育中起重要的調(diào)控作用。近年的研究證實(shí)，Runx2的轉(zhuǎn)錄共激活功能是通過(guò)Taz實(shí)現(xiàn)的，在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中Taz作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄共激活劑在細(xì)胞核中的定位可激活Runx2的表達(dá)，從而促進(jìn)骨的形成[16]。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)的方法觀察Taz與Runx2在牙齒發(fā)育中的表達(dá)與定位，探討二者在牙齒發(fā)育中的作用。

研究結(jié)果顯示，在蕾狀期，Taz、Runx2兩種蛋白在口腔上皮及周圍的間充質(zhì)細(xì)胞中呈陽(yáng)性表達(dá)；當(dāng)牙胚發(fā)育至帽狀期，Taz、Runx2的陽(yáng)性著色存在于牙囊、牙乳頭及釉結(jié)，此外，Taz在口腔上皮中仍存在表達(dá)。隨著牙胚的發(fā)育Taz的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，至鐘狀早期，整個(gè)成釉器的各層細(xì)胞及牙囊中均呈陽(yáng)性表達(dá)，Runx2的表達(dá)多集中于內(nèi)釉上皮層、中間層、牙乳頭及牙囊。有研究報(bào)道Runx2可能調(diào)控多個(gè)信號(hào)通路的多個(gè)基因，在由蕾狀期向帽狀期過(guò)渡的牙胚早期發(fā)育中發(fā)揮重要作用[17]，基于Taz與Runx2在牙胚早期相似的特異性表達(dá)與定位，我們推測(cè)Taz可能在牙胚早期發(fā)育過(guò)程中也發(fā)揮著重要的作用。此外，釉結(jié)呈密集的細(xì)胞團(tuán)狀，是調(diào)控牙齒形態(tài)重要的臨時(shí)性結(jié)構(gòu)[18-20]。Li 等[21]的研究報(bào)道釉結(jié)是蕾狀期形成的重要結(jié)構(gòu)，釉結(jié)的主要功能是分泌一系列的信號(hào)分子，共同調(diào)節(jié)牙齒形態(tài)的發(fā)生。釉結(jié)的形成主要依賴于αE-catenin通過(guò)Yap及其同源物Taz的信號(hào)傳遞功能。αE-catenin在牙齒發(fā)育過(guò)程中的粘附功能與其在釉結(jié)形成中的作用是分離的，釉結(jié)形成涉及到Y(jié)ap/Taz信號(hào)通路的調(diào)控。本研究中免疫組織化學(xué)染色顯示Taz在釉結(jié)處存在陽(yáng)性著色，提示Taz可能參與牙齒形態(tài)的發(fā)生過(guò)程中信號(hào)通路的調(diào)控，與Li等的研究相近，但本研究尚未進(jìn)行深入機(jī)制的研究及探討。大鼠下頜第一磨牙牙胚的免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，在PN7天牙冠的發(fā)育即將完成，在成釉細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞層及牙本質(zhì)基質(zhì)中Taz的陽(yáng)性著色最為明顯，除此之外，在中間層及上皮根鞘處也檢測(cè)出Taz的表達(dá)，表明Taz可能參與成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化及釉質(zhì)和牙本質(zhì)的形成，同時(shí)在牙根的發(fā)育中也起到一定的調(diào)控作用。隨著牙冠發(fā)育的完成，Taz在成釉細(xì)胞中的表達(dá)減弱，在成牙本質(zhì)細(xì)胞中的陽(yáng)性著色由牙冠向根尖方向逐漸降低。至PN21、PN28天，在牙周膜及牙槽骨等牙周組織中可發(fā)現(xiàn)Taz與Runx2均存在特異性表達(dá)。根據(jù)以往的研究發(fā)現(xiàn)，Taz與Runx2的相互作用可以促進(jìn)成骨因子的表達(dá)，因此，我們推測(cè)Taz可能通過(guò)對(duì)Runx2的調(diào)控實(shí)現(xiàn)對(duì)牙槽骨、牙周膜等牙周組織發(fā)育的調(diào)節(jié)。

ab：成釉細(xì)胞；ob：成牙本質(zhì)細(xì)胞；em：釉質(zhì)基質(zhì)；d：牙本質(zhì)；PDL：牙周膜；AB：牙槽骨；HERS：上皮根鞘

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組織化學(xué)染色觀察Taz、Runx2在大鼠下頜第一磨牙發(fā)育中的時(shí)空特異性表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Taz與Runx2的表達(dá)與定位具有一定的一致性，推測(cè)Taz可能參與牙齒發(fā)育的調(diào)控，此外，Taz可能通過(guò)調(diào)控Runx2的表達(dá)參與成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化及牙根和牙周組織的發(fā)育。然而，對(duì)于具體的調(diào)控機(jī)制尚不明確仍需進(jìn)一步的探索研究。