羅世波， 吳江妮， 丘新澤， 梁志海， 劉詩權(quán)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是常見的惡性腫瘤之一，CRC所致死亡約占腫瘤相關(guān)死亡的10%[1]。目前，我國的CRC發(fā)病率呈逐年增長的趨勢[2]。盡管在診斷和治療方面取得了進步，但在過去的20年中，CRC患者的存活率并未得到顯著的改善，50%以上的患者在確診時已發(fā)生區(qū)域性或遠處轉(zhuǎn)移[3]。鈣激活的氯離子通道輔助蛋白1(calcium-activated chloride channel regulator 1,CLCA1)是鈣激活的氯離子通道調(diào)節(jié)蛋白家族成員，其基因組序列由31 902個堿基對組成，具有15個外顯子和14個內(nèi)含子，位于1號染色體的短臂上(p22-31)[4]，參與調(diào)節(jié)上皮細胞氯化物電流，并與黏液分泌過多相關(guān)呼吸道和胃腸道疾病的發(fā)生發(fā)展具有關(guān)聯(lián)性[5]。CLCA1參與上皮細胞膜的氯離子傳導(dǎo)，可影響上皮黏液產(chǎn)生、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞黏附、細胞周期控制、凋亡以及腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移等[6]。有研究顯示，人CLCA1主要在小腸和結(jié)腸黏膜中表達[4]。而針對CRC標(biāo)本的研究表明，CLCA1表達水平與腫瘤分期呈負相關(guān)[7]，但也有研究發(fā)現(xiàn)CLCA1高表達與CRC患者的不良預(yù)后有關(guān)[8]。由此可見，CLCA1在CRC中的作用機制尚未完全闡明。鑒此，本研究旨在探討CLCA1在CRC中的表達情況及其與臨床特征的關(guān)系，為CRC患者的診斷和預(yù)后預(yù)測提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)來源 通過腫瘤基因組圖譜(the Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga)下載CRC樣本CLCA1基因的表達數(shù)據(jù)及其匹配的臨床信息。臨床信息包括TNM分期、血管侵襲情況、腫瘤狀態(tài)、生存資料等。排除臨床信息不全的樣本，最終共納入370例CRC原發(fā)樣本和51例癌旁組織樣本進行分析。

1.2標(biāo)本來源 選擇2013年3月至2014年3月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院接受手術(shù)治療的CRC患者50例，均經(jīng)影像及病理檢查確診。收集其腫瘤組織和癌旁組織(距離腫瘤邊緣>10 cm)各50例。排除在手術(shù)前接受過化學(xué)療法或放射療法的患者，排除合并其他腫瘤或慢性疾病者，排除有吸毒史患者。

1.3方法

1.3.1 生物信息學(xué)分析方法[9]應(yīng)用GSEA軟件對獲取自TCGA數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進行分析，將CLCA1基因表達水平的中位數(shù)作為截斷值，分為高表達組和低表達組。通過基因集數(shù)據(jù)庫(MsigDB數(shù)據(jù)庫)的致癌基因集進行基因集富集分析，設(shè)置置換檢驗的次數(shù)為1 000次。有意義的基因集的篩選條件：錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)<25%，且P<0.05。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色方法 將收集到的臨床標(biāo)本進行石蠟包埋組織切片，厚度4～5 μm，提前4 ℃預(yù)冷，60 ℃烘箱烤片30 min，烘干后用二甲苯進行脫蠟，梯度洗脫脫水。滴加3% H2O2溶液至標(biāo)本上，濕盒中室溫靜置15 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。滴加山羊血清封閉液(北京中杉金橋生物公司)，濕盒中室溫靜置15 min。滴加CLCA1一抗(工作濃度為1∶4 000；Abcam公司，英國)，濕盒中4 ℃孵育過夜。復(fù)溫，使用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)沖洗3次，滴加生物素標(biāo)記二抗(北京中杉金橋生物公司)，濕盒中37 ℃孵育15 min。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素(北京中杉金橋生物公司)，濕盒37 ℃孵育15 min；PBS浸洗3次，5 min/次。應(yīng)用3，3-二氨基苯聯(lián)胺(diaminobenzidine,DAB)顯色劑和蘇木素進行復(fù)染，最后滴加適量中性樹膠封片，于顯微鏡下進行觀察。

1.3.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定[10]免疫組織化學(xué)染色結(jié)果由3名專業(yè)人員采用半定量法進行獨立評判。以胞質(zhì)中出現(xiàn)明顯黃色或棕黃色顆粒判定為陽性。綜合染色強度及陽性細胞數(shù)量進行半定量分析，根據(jù)陽性細胞染色強度(A)：無明顯著色為0分；細胞漿內(nèi)出現(xiàn)淡黃色顆粒，明顯高于背景為1分；出現(xiàn)較多棕黃色顆粒為2分；出現(xiàn)大量棕褐色顆粒為3分。每個組織隨機觀察5個高倍鏡視野，計數(shù)500個細胞中染色陽性細胞所占比率(B)：陽性細胞數(shù)<5%為0分；5%～25%為1分；26%～50%為2分；>50%為3分。A與B相加為最終得分，以0～2分判定為陰性(-)，≥3分判定為陽性(+)。

2 結(jié)果

2.1免疫組織化學(xué)染色評分比較 CRC組織中CLCA1表達較癌旁組織明顯降低，見圖1。CRC組織的免疫組織化學(xué)染色評分為(2.46±1.09)分，低于癌旁組織的(5.65±0.49)分，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.458，P=0.000)。

圖1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果圖(×200)

2.2CLCA1 mRNA表達水平與臨床分期的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果 癌旁組織的CLCA1 mRNA表達水平顯著高于臨床Ⅰ～Ⅱ期CRC組織和臨床Ⅲ～Ⅳ期CRC組織(P<0.05)，臨床Ⅰ～Ⅱ期CRC組織的CLCA1 mRNA表達水平顯著高于臨床Ⅲ～Ⅳ期CRC組織(P<0.05)。見表1。

表1 CLCA1 mRNA表達水平與臨床分期的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果[M(P25，P75)]

2.3CLCA1高表達組與低表達組臨床病理特征比較 CLCA1高表達組臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、N分期為N0期以及M分期為M0期的人數(shù)比例顯著大于CLCA1低表達組(P<0.05)。兩組T分期比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 CLCA1高表達組與低表達組臨床病理特征比較(n)

2.4CLCA1表達水平與預(yù)后關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果 CLCA1高表達組的生存預(yù)后顯著優(yōu)于CLCA1低表達組，兩組生存時間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(log-rank檢驗：χ2=8.200，P=0.004)。見圖2。

圖2 CLCA1高表達組與CLCA1低表達組生存曲線圖

2.5CLCA1基因表型富集分析結(jié)果 共納入188個致癌基因的基因集進入分析，結(jié)果顯示，有180個基因集在CLCA1高表達表型中富集，其中19個基因集在FDR<25%的條件下顯著富集，21個基因集在P<0.05的條件下顯著富集。FDR<25%且P<0.05條件下富集的基因集共有19個。見表3。有8個基因集在CLCA1低表達表型中富集，但是沒有基因集顯著富集在該表型中。

表3 19個CLCA1高表達表型中顯著富集的基因集

續(xù)表3

3 討論

3.1盡管CRC的全人群發(fā)病率有所改善，但其在<50歲患者中的發(fā)病率卻在不斷上升。預(yù)估至2030年，年齡為20～34歲者的結(jié)腸癌和直腸癌發(fā)病率將分別增加90.0%和124.2%[11]。目前存在以手術(shù)治療為主的各種治療手段，但是CRC患者的5年生存率仍較低[12]。因此，探索新的生物標(biāo)志物對于CRC的診斷、治療、預(yù)后預(yù)測具有重要意義。CLCA1參與調(diào)節(jié)Ca2+激活的氯離子在上皮細胞上的轉(zhuǎn)運、杯狀細胞的黏蛋白表達、單核細胞和巨噬細胞的細胞因子和趨化因子表達、腫瘤細胞遷移和轉(zhuǎn)移等過程[5]。氯通道，尤其是Ca2+激活的氯通道參與了細胞增殖、遷移和轉(zhuǎn)移等活動，可作為治療癌癥新興藥物的作用靶點[13-15]。有研究顯示，CLCA1與癌癥進展密切相關(guān)[16]。離子通道與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展和耐藥性均具有關(guān)聯(lián)[17]。蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果顯示，CLCA1在卵巢癌細胞系和腫瘤聚集形成細胞模型中表達增加，且敲降CLCA1表達可降低癌細胞形成多細胞聚集體的能力[18]。在肺癌研究中發(fā)現(xiàn)，β4整合素連接CLCA1激活下游粘著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular-signal-regulated kinase，ERK)信號通路并與之形成復(fù)合物，促進肺癌細胞早期的血管內(nèi)生長和轉(zhuǎn)移性生長[19]。有研究提示，低水平的CLCA1與胰腺癌的不良預(yù)后顯著相關(guān)，是胰腺癌無病生存期較差的獨立因素[20-21]。因此，CLCA1在不同類型的癌癥中的作用機制可能不同。本研究結(jié)果顯示，CLCA1在CRC組織中表達下調(diào)，且與不良預(yù)后具有關(guān)聯(lián)，這與相關(guān)研究結(jié)果相似[22-23]。

3.2本研究結(jié)果顯示，與癌旁組織比較，CRC組織中CLCA1 mRNA表達水平顯著降低，提示CLCA1可能是CRC的潛在標(biāo)志物。另外，結(jié)果顯示CLCA1水平與臨床分期、N分期、M分期存在關(guān)聯(lián)，但與T分期關(guān)聯(lián)性不顯著，提示CLCA1下調(diào)可能會促進CRC轉(zhuǎn)移，但與腫瘤的浸潤相關(guān)性不顯著。以上結(jié)果提示，CLCA1可能是CRC的腫瘤抑制因子，但這與Chen等[8]的研究結(jié)論相反，這可能是由于樣本量、患者特征差異所導(dǎo)致。研究認為，CLCA1通過抑制Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)過程抑制CRC侵襲[24]，且CLCA1的轉(zhuǎn)錄與原癌基因c-myc的持續(xù)轉(zhuǎn)錄相關(guān)[20]，而c-myc基因的產(chǎn)物參與調(diào)控細胞的增殖與凋亡[25]。本研究結(jié)果顯示，CLCA1高表達表型中顯著富集的基因集有19個，且不局限于Wnt/β-catenin信號通路。因此，CLCA1可能與其他原癌基因相互作用來調(diào)控腫瘤細胞的增殖與凋亡。

3.3本研究基因集富集分析結(jié)果顯示，人類絲氨酸/蘇氨酸激酶33(serine/threonine kinase 33，STK33)在CLCA1高表達表型中下調(diào)。STK33屬于鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性激酶家族，位于11p15.3號染色體上，此位點為與多種疾病(包括癌癥)相關(guān)的基因富集區(qū)域[26]。STK33通過ERK2信號通路促進CRC的發(fā)生[26]。研究發(fā)現(xiàn)，STK33通過激活磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路促進人胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的生長和進展[27]。本研究結(jié)果顯示，CLCA1高表達可下調(diào)CRC組織的STK33表達水平，說明CLCA1可能是通過抑制STK33介導(dǎo)的信號通路來抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。值得注意的是，基因集富集分析結(jié)果顯示，在CLCA1高表達情況下AKT表達呈上升狀態(tài)。而在多種腫瘤中，PI3K/AKT/mTOR通路與癌癥的發(fā)病機制相關(guān)，是腫瘤發(fā)生的促進因素[28]。分析認為CLCA1與AKT可能存在某種特殊的結(jié)合方式，從而改變了AKT的功能[5]。

綜上所述，CLCA1與CRC的發(fā)生、發(fā)展具有顯著關(guān)聯(lián)，其有望成為CRC診斷、治療和預(yù)后預(yù)測的標(biāo)志物。但CLCA1與其他基因共同影響CRC的惡性生物行為的具體分子機制還有待于進一步驗證，還需要深入研究它們之間的結(jié)合位點及亞型。