向 蓉，舒柄垚，高 原，李亞暉，魏光偉,2，唐興剛,2，郭偉干,2，羅勝軍,2*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省中獸藥工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510640；2.廣東省前沿動(dòng)物保健有限公司,廣東 廣州510550；3.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心，廣東 茂名 525000；4.珠海市啟信達(dá)生物科技有限公司，廣東 珠海 519000)

2019年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194號(hào)公告正式發(fā)布，規(guī)定自2020年1月1日起，退出除中藥外的所有促生長(zhǎng)類藥物飼料添加劑品種，正式開啟了我國(guó)飼料禁抗新紀(jì)元。因此，尋找飼用抗生素的高效替代產(chǎn)品成為目前當(dāng)務(wù)之急。天然植物因具有多種活性物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分，能全面調(diào)節(jié)機(jī)體的生理功能[1-3]、提高動(dòng)物生產(chǎn)性能[4-5]、增強(qiáng)機(jī)體免疫力[6-7]、提高飼料轉(zhuǎn)化率[8]，且有天然環(huán)保無(wú)殘留，毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)[9]，在養(yǎng)殖中已有大規(guī)模使用，成為替抗產(chǎn)品最佳選擇之一[10]。

牡荊(Vitexnegundo L.var.cannabifolia(Sieb.et Zucc.) Hand.-Mazz.)是一種傳統(tǒng)的藥用植物，屬于馬鞭草科(Verbenaceae)牡荊屬(Vitex)。人們對(duì)牡荊屬其他植物如蔓荊、黃荊、穗花牡荊等進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)牡荊屬植物大多具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化等多種生物活性[11-14]。但是目前對(duì)牡荊的研究報(bào)道較少，已有報(bào)道大多集中于對(duì)牡荊子的化學(xué)成分和生物活性的研究上[15]，而對(duì)于牡荊枝、葉的基礎(chǔ)研究及其應(yīng)用的報(bào)道還較少。牡荊的開發(fā)利用主要集中在人醫(yī)，由牡荊葉提取的揮發(fā)油制成的油膠丸已載入中國(guó)藥典[16]，但在獸醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用還是一片空白。本課題組在前期動(dòng)物試驗(yàn)基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)牡荊提取物有較好的抗腹瀉作用。鑒于此，本研究利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS)技術(shù)對(duì)牡荊水提物和醇提物進(jìn)行化學(xué)成分分析，并通過(guò)DPPH自由基清除能力測(cè)試評(píng)價(jià)兩種提取物的抗氧化能力。以期了解其主要活性成分及體外抗氧化能力，為牡荊作為中獸藥及飼料添加劑在養(yǎng)殖業(yè)中進(jìn)一步開發(fā)利用提供基礎(chǔ)理論支撐。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑牡荊采自廣東省廣州市，經(jīng)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)郭世寧教授鑒定為馬鞭草科牡荊屬植物牡荊。藥材采集后切成小段，經(jīng)50℃烘干后，用中藥粉碎機(jī)粉碎成粗粉，過(guò)20目篩，備用；無(wú)水乙醇(分析純A.R.)、抗壞血酸(Vc)均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ,DPPH)購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器和設(shè)備離子淌度-Q-TOF高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀(Synapt G2-Si),美國(guó)Waters公司；ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100.0 mm，1.7 μm),美國(guó)Waters公司；酶標(biāo)儀(EL×800)，美國(guó)BioTek公司；超純水系統(tǒng)(Moldene 1820a)，重慶摩爾實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 牡荊提取物的制備牡荊水提物的制備：稱取5 g牡荊粉于圓底燒瓶中，加入50 mL超純水(料液比1∶10)，加熱煮沸回流提取1 h后抽濾，收集濾液并再次向?yàn)V渣中加入50 mL超純水煮沸1 h，合并2次濾液定容至100 mL，4℃保存待用。

牡荊醇提物的制備：稱取5 g牡荊粉于圓底燒瓶中，加入50 mL 不同濃度乙醇煮沸回流提取1 h，抽濾后再次向?yàn)V渣中加入50 mL 相同濃度乙醇提取1 h，合并2次濾液定容至100 mL，4℃保存待用。乙醇濃度分別采用95%，80%，70%，60%，50%，獲得對(duì)應(yīng)濃度的醇提物。

1.4 DPPH自由基清除試驗(yàn)溶液的制備待測(cè)溶液的制備：用水和無(wú)水乙醇分別稀釋牡荊水提液和醇提液，水提液分別稀釋至生藥質(zhì)量濃度為1.500，1.000，0.500，0.250，0.125 g/L；95%醇提液分別稀釋到5.000，4.000，3.000，2.000，1.000 g/L；80%醇提液分別稀釋到3.000，2.500，2.000,1.000,0.500 g/L；70%醇提液、60%醇提液、50%醇提液均稀釋至2.000，1.500，1.000，0.500，0.250 g/L。

DPPH溶液的制備：精密稱取4.000 mg DPPH粉末，用無(wú)水乙醇溶解定容至10 mL，得質(zhì)量濃度為0.400 g/L的DPPH母液，4℃避光保存?zhèn)溆?；使用時(shí)以無(wú)水乙醇稀釋為0.080 g/L的工作液。

Vc溶液的制備：精密稱取8.000 mg Vc，用無(wú)水乙醇溶解制成0.800 g/L的Vc母液，依次用無(wú)水乙醇稀釋為質(zhì)量濃度分別為0.020，0.015，0.010，0.005，0.002 g/L的Vc對(duì)照液。

1.5 液相色譜條件以0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相(A)，以0.1%甲酸乙腈為流動(dòng)相(B)，梯度洗脫為0～1.0 min，2% B；1.0～25.0 min，98%～5% B；25.0～32.0 min，5% B；32.0～32.2 min，5%～98% B；32.2～35.0 min，98% B。柱溫40℃，流速0.3 mL/min，梯度洗脫(A.水；B.乙腈,均含0.1%甲酸)

1.6 質(zhì)譜條件電離方式：+/- ESI離子掃描模式；毛細(xì)管電壓：2.5 kV；錐孔電壓：35 V；源溫度：120℃；脫溶劑氣溫度：350℃；氣簾氣：40 L/h；脫溶劑氣：750 L/h；霧化氣：6.500 Bar。

1.7 DPPH自由基清除試驗(yàn)試驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[17]，以Vc為陽(yáng)性對(duì)照組，在96孔板中分別加入不同濃度的牡荊提取液稀釋液和100 μL DPPH自由基工作液，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將96孔板放入酶標(biāo)儀中振蕩1 min后室溫、避光靜置30 min，在517 nm處測(cè)定D值，計(jì)算各組自由基清除率，并計(jì)算IC50值。

清除率(%)=[1-(D樣品-D本底)/D空白] ×100%

D樣品為供試品與DPPH反應(yīng)后的吸光度值；D本底為供試品中未加 DPPH反應(yīng)液時(shí)的吸光度值；D空白為溶劑與DPPH反應(yīng)后的吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 UPLC-MS分析結(jié)果本研究對(duì)牡荊70%醇提液和水提液進(jìn)行了UPLC-MS分析，采用正負(fù)離子掃描模式，其正、負(fù)離子流圖分別如圖1，2所示。

A.牡荊醇提液離子流圖;B.牡荊水提液離子流圖

A.牡荊醇提液離子流圖;B.牡荊水提液離子流圖

通過(guò)對(duì)一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，在醇提液和水提液中共檢測(cè)出77種化合物的信息，其中水提液和醇提液共有的化合物有44種，醇提液獨(dú)有的有22種，水提液獨(dú)有的有11種。

2.2 牡荊提取物主要化學(xué)成分分析結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)、MassBank數(shù)據(jù)庫(kù)以及參考文獻(xiàn)等，共確定22種化合物的結(jié)構(gòu)信息，主要包括酚酸類、黃酮類以及環(huán)烯醚萜類等化合物。如表1所示，其中黃酮類化合物有11種(表1中8～12，14，17，19～22)，酚酸類化合物有8種(表1中2～3，5～7，15～16，18)，環(huán)烯醚萜類3種(表1中1，4，13)。

表1 牡荊提取液中化合物離子結(jié)構(gòu)信息

續(xù)表1

續(xù)表1

2.3 DPPH自由基清除能力評(píng)價(jià)不同濃度的牡荊水提液及醇提液均具有一定的DPPH自由基清除能力，IC50結(jié)果如表2所示。牡荊醇提液的IC50值隨提取時(shí)醇濃度的升高反而降低，而牡荊水提液清除DPPH自由基的IC50值為生藥質(zhì)量濃度0.860 g/L，顯著低于牡荊醇提液，說(shuō)明牡荊水提液的抗氧化能力強(qiáng)于醇提液。

表2 不同牡荊提取液對(duì)DPPH自由基清除能力

3 討論

牡荊屬植物大多為藥用植物，具有多種活性成分。李春正等[18]對(duì)國(guó)內(nèi)外牡荊屬植物的化學(xué)成分進(jìn)行綜述，已從牡荊屬植物中分離出206種化合物。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外關(guān)于牡荊屬植物化學(xué)成分的研究報(bào)道也越來(lái)越多，該屬植物新發(fā)現(xiàn)了多種化合物。徐堯等[19]從蔓荊子乙醇提取物中分離得到15個(gè)化合物，其中(E)-3,3′-二甲氧基-4,4′-二羥基二苯乙烯、(8R)-evofolin B、覆盆子酮、芐基-β-D-葡糖苷、云杉苷和4-(4′-羥基苯基)-2-丁酮-4′-O-β-D-吡喃葡糖苷為首次從牡荊屬植物中分離得到。NIU等[20]在荊條葉70%醇提物中分離鑒定出10種環(huán)烯醚萜類化合物，其中化合物1號(hào)nishindacin A和2號(hào)isonishindacin A 為新發(fā)現(xiàn)的環(huán)烯醚萜類化合物。SICHAEM等[21]從荊條葉中分離出vitexnegundin，牡荊內(nèi)酯，vitetrifolin D等9種化合物，其中vitexnegundin為一種新的半日花烷型二萜類化合物。但是目前對(duì)牡荊的相關(guān)研究大多集中于牡荊子的化學(xué)成分和生物活性，而對(duì)于牡荊枝、葉的基礎(chǔ)研究及其應(yīng)用的報(bào)道還較少。本研究基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)牡荊化學(xué)成分進(jìn)行分析，從牡荊細(xì)枝和葉的不同溶劑提取液中共分離出77種化合物，鑒定出了其中22種化合物的結(jié)構(gòu)，主要有黃酮類、酚酸類和環(huán)烯醚萜類等物質(zhì)，牡荊醇提液和水提液均含有這幾類物質(zhì)，但從總離子流圖來(lái)看牡荊水提液中總的物質(zhì)種類少于醇提液。從已比對(duì)出的疑似化合物成分看，牡荊中含有較多的黃酮類和酚酸類化合物，以牡荊素為代表的黃酮類化合物能顯著提高動(dòng)物生產(chǎn)性能，提高動(dòng)物機(jī)體抗病力，改善動(dòng)物機(jī)體免疫機(jī)能。酚酸類化合物主要是綠原酸及其衍生物。綠原酸已被報(bào)道是一種具有抗炎、抗氧化、抗菌抗病毒、降糖降脂等多種功能的生物活性物質(zhì)[22]，應(yīng)該在牡荊的生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用。因受參考文獻(xiàn)和查閱數(shù)據(jù)庫(kù)的限制，本研究中比對(duì)出的疑似化合物數(shù)量有限，其余成分的確定有待進(jìn)一步分析，單體化合物的驗(yàn)證也需要下一步試驗(yàn)。

利用天然植物提取物作為體外抗氧化劑已成為食品、化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前大量研究發(fā)現(xiàn)酚酸類[23]、黃酮類[24]、皂苷類[25]、多糖類[26]等化合物均具有較好的抗氧化活性。本研究以DPPH法研究牡荊不同濃度醇提液和水提液的抗氧化活性。發(fā)現(xiàn)不同濃度的牡荊醇提液和牡荊水提液均具有一定的抗氧化活性，牡荊水提液具有較好的清除DPPH自由基的能力，其IC50值為生藥質(zhì)量濃度0.860 g/L。醇提液清除DPPH自由基的能力顯著低于水提液，且隨著醇濃度的升高而降低。這說(shuō)明牡荊中主要的抗氧化活性物質(zhì)更適合水提方法進(jìn)行提取。從前述化學(xué)成分研究發(fā)現(xiàn)酚酸類、黃酮類物質(zhì)是其主要活性成分，大量的研究也證實(shí)酚酸類物質(zhì)如綠原酸、黃酮類物質(zhì)均具有較好的抗氧化活性。

本研究對(duì)牡荊中的化學(xué)成分及其抗氧化能力進(jìn)行初步分析，有助于了解其潛在的生物活性，同時(shí)為其后續(xù)的進(jìn)一步研究利用提供物質(zhì)成分方面的基礎(chǔ)支撐。