紀開燕，楊 玲，吳姣姣，蔣明星，韓秀林，魯 濤

(云南大學 生命科學學院，云南省微生物研究所，云南 昆明 650091)

格爾德霉素（geldanamycin，GM）是由放線菌產生的苯醌安莎類抗生素，因其具有極強的抗腫瘤活性，自發(fā)現(xiàn)以來就引起了研究者廣泛關注，是有很好開發(fā)應用前景的藥物.GM 的作用靶點是Hsp90，其能夠特異性地抑制Hsp90 氨基端ATP 酶活性[1-2]，多種腫瘤相關蛋白皆需依賴Hsp90 ATP 酶來行使其功能.Hsp90 ATP 酶活性受到抑制導致該類蛋白降解，最終引起腫瘤細胞死亡[3-5].但是，此類化合物有肝毒性較強、水溶性差等缺點，阻礙了臨床的開發(fā)應用，因此有必要研究其生物合成途徑，以期對其進行基因改造或尋找其類似物[6-7].對GM 及其類似物生物合成的深入研究有助于對此類化合物的進一步研發(fā).

關于GM 的生物合成途徑已經有了一些研究[8-12]，這些研究表明LuxR 家族調控子GdmRⅠ和GdmRⅡ及TetR 家族調控子GdmRⅢ在格爾德霉素的生物合成中都起到正調控作用.我們克隆并測序了自溶鏈霉菌（Streptomyces autolyticus）CGMCC 0516 中格爾德霉素生物合成基因簇[13-14]，并證明了其中GdmRⅠ、GdmRⅡ及GdmRⅢ同樣在格爾德霉素的生物合成中都起到正調控作用[15].但是，此類化合物生物合成的一些調控細節(jié)尚未完全解析.

在自溶鏈霉菌GM 生物合成基因簇中存在一個功能未知的基因orf17.該基因編碼的蛋白屬于MarR（multiple antibiotic resistance regulator）多重耐藥調控蛋白.MarR 蛋白家族是原核生物的一個多效性轉錄調控子，通過與靶標DNA 結合從而阻遏轉錄[16]，參與細菌多種生命進程的調控，如抗藥性和毒力因子相關基因的表達調控等，在致病菌適應外界壓力的過程中也起到關鍵作用[17-19].在本工作中，我們對自溶鏈霉菌中Orf17 的功能進行了研究，成功構建了orf17突變株，并對突變株不同階段的發(fā)酵產物進行了HPLC 分析；同時，采用RT-PCR對格爾德霉素生物合成相關基因在orf17突變株中的表達進行了分析；此外，分離純化了突變株中產量提高的3 個化合物，并對其進行了結構鑒定.研究結果初步表明Orf17 正調控自溶鏈霉菌中格爾德霉素的生物合成，可能負調控自溶鏈霉菌中洋橄欖 葉素的生物合成.

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒和培養(yǎng)條件所用的菌株及質粒見表1.質粒pHY773 和pSA267 分別由中國科學院上海植物生理與生態(tài)研究所覃重軍老師和云南大學尹敏老師惠贈.鏈霉菌產孢使用ISP4（BD Difco，USA）培養(yǎng)基，于28 ℃平板培養(yǎng)；種子液培養(yǎng)基為TSB（BD Difco，USA）培養(yǎng)基，在28 ℃下振蕩培養(yǎng)；發(fā)酵所用培養(yǎng)基為61﹟培養(yǎng)基（酵母粉2 g，魚蛋白胨2 g，可溶性淀粉5 g，大豆粉5 g，葡萄糖20 g，CaCO32 g，NaCl 4 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO40.5 g，pH=7.8，雙蒸水定容至1 000 mL），在28 ℃下振蕩培養(yǎng).大腸桿菌（Escherichia coli）培養(yǎng)使用Luria-Bertani（LB）液體/固體培養(yǎng)基（酵母提取物5 g，NaCl 10 g，胰蛋白胨10 g，pH=7.0，去離子水定容至1 000 mL，配制固體培養(yǎng)基時加入10 g/L 瓊脂）.若無 特別說明，大腸桿菌培養(yǎng)條件均為37 ℃.

表1 菌株和質粒Tab.1 Strains and plasmids

1.2 引物PCR 引物見表2，使用Primer Premier 5 .0 軟件設計，由上海生工生物工程有限公司合成.

表2 本研究使用的引物Tab.2 Primers used in this study

1.3 化學試劑及酶所用的抗生素質量濃度分別為：阿伯拉霉素（Apra）25 μg/mL，卡那霉素（Kan）25 μg/mL，氨芐青霉素（Amp）50 μg/mL，硫鏈絲菌素（Thio）10 μg/mL，萘啶酸（Nal）15 μg/mL，氯霉素（Cm）20 μg/mL.所用抗生素均先配制成母液，其中氯霉素和硫鏈絲菌素分別用乙醇和DMSO 配制，萘啶酸用0.1 mol/L 的NaOH 溶解，其它抗生素均用無菌水配制，儲存于-20 ℃?zhèn)溆?LATaq和ExTaqDNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶、限制性內切酶Hind Ⅲ、XhoⅠ、BamH Ⅰ、PstⅠ和EcoR Ⅰ，以及試劑盒Universal RNA Extraction Kit 和PrimeScriptTMRT Reagent Kit（Perfect Real Time）等均購自大連寶生物公司.TransTaqDNA Polymerase High Fidelity（HiFi）購自北京全式金生物公司.細菌基因組、高純質粒小量制備和瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自北京百泰 克公司.

1.4orf17突變株構建及產物檢測以自溶鏈霉菌CGMCC 0516 為出發(fā)菌株，采用PCR-targeting 方法敲除orf17基因構建其突變株，方法參照文獻[22].對野生型菌株和orf17突變株進行液體發(fā)酵，先將菌株于ISP4 平板上劃線，28 ℃下培養(yǎng)36～48 h 后，再挑取單菌落劃線于ISP4 固體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3～4 d，待其產孢后用已滅菌的10%甘油將孢子洗出備用；然后按1%的接種量將新鮮孢子液接入50 mL TSB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min 搖瓶培養(yǎng)36～48 h 獲得種子液；以1%的接種量將種子液接入50 mL 61#發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min 搖瓶培養(yǎng)3～13 d 獲得發(fā)酵液.離心收集發(fā)酵液的上清和菌體，上清用等體積乙酸乙酯萃取2 遍，菌體用丙酮浸泡過夜，萃取液分別于40 ℃旋轉蒸干，甲醇溶解后合并待測.使用Agilent 1 200 高效液相（Luna XBD-C18Φ4.60×250 mm 5-Micron）分析樣品，梯度洗脫流動相為水和甲醇，流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為254 nm.洗脫過程分3 步：第1 步，30%～100%甲醇，洗脫0～25 min；第2 步，100%甲醇，洗脫25～30 min；第3 步，30%甲醇，洗脫 30～35 min.

1.5 RT-PCR自溶鏈霉菌總RNA 的提取、cDNA的合成及RT-PCR 檢測均參照試劑盒說明書進行操 作.

1.6 化合物的分離純化將orf17突變株進行液體發(fā)酵，取第5、7、9 天的發(fā)酵液，按前述方法獲得粗提液.然后將粗提液進行TLC 層析（展開劑：V(石油醚)∶V(丙酮)=7∶3；V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=7∶3；V(氯 仿)∶V(甲 醇)=95∶5；V(氯 仿)∶V(丙酮)=95∶5；V(氯仿)∶V(丙酮)=9∶1；V(氯仿)∶V(甲醇)=9∶1）.根據TLC 層析結果，選擇正向硅膠進行梯度洗脫劃段，流動相分別為純氯仿、氯仿/甲醇（V(氯仿)∶V(甲醇)=40∶1；20∶1；15∶1；9∶1）及純甲醇.采用凝膠柱對收集到的40∶1 段和20∶1段進行進一步分離.之后用反向硅膠C18 對其進行梯度洗脫，流動相分別為乙腈-水（V(乙腈)∶V(水)=7∶3，8∶2，9∶1）及純乙腈.最后用半制備LC3000 liquid chromatograph system進行制備，流動相為70%～100%乙腈-水，獲得化合物純品.之后通過質譜檢測確定這3 個化合物的相對分子質量，再根據1H NMR、13C-DEPT NMR、HSQC、HMBC、1H-1H COSY 和ROESY 對其進行結構解析.

2 結果與分析

2.1orf17基因在格爾德霉素生物合成中的作用為了了解自溶鏈霉菌CGMCC 0516 格爾德霉素生物合成基因簇中orf17基因的功能，我們采用一步PCR 法構建了其orf17敲除突變株，經PCR 擴增（圖1）和序列測定驗證，此突變株構建正確.

圖1 orf17 突變株的PCR 驗證Fig.1 Verification of the orf17 mutant by PCR amplification

HPLC 檢測野生型菌株和orf17突變株的發(fā)酵產物，結果顯示：在整個發(fā)酵期間，突變株中格爾德霉素的產量相較野生型菌株明顯降低（圖2（a）～（i）），其中第5 天格爾德霉素的產量比野生型減少了53.7%；第7 天產量減少了52.8%；第9 天產量減少了44.1%；第11 天產量減少了56.7%（圖2（j））.說明Orf17 可能參與了格爾德霉素生物合成中相關基因的表達調控，并且起到了正調控作用.

雖然在orf17突變株中格爾德霉素的產量明顯降低，但仍可以在發(fā)酵產物中檢測到該化合物，表明其合成途徑并沒有被完全阻斷，并且在整個發(fā)酵過程中，格爾德霉素的產量變化趨勢與野生型是一致的，這說明格爾德霉素的生物合成是一個復雜的代謝過程，眾多細胞因子都參與了該合成途徑的基因調控，Orf17 只是其中一個調控蛋白.此外，有3 個化合物（化合物1、化合物2 和化合物3）在突變株中的產量與野生型相比大大提高，在發(fā)酵第9天 時最為明顯（圖2（g））.

圖2 野生型和orf17 突變株中化合物的HPLC 分析Fig.2 Analysis of the production of compounds in the wide-type strain and the orf17 mutant

2.2 格爾德霉素生物合成相關基因在orf17突變株中的表達為了尋找Orf17 可能調控的靶基因，我們根據生物信息學分析選取了10 個與格爾德霉素生物合成相關的基因，分析了其在野生型和orf17突變株中的轉錄表達差異.這些基因分別為：前體合成基因almK和almH（與almI、almJ和almG共同參與甲氧基丙二酸-ACP 生物合成）；聚酮鏈骨架合成基因almAⅠ（編碼聚酮合酶）；調控基因almRⅠ、almRⅡ和almRⅢ（編碼轉錄調控蛋白AlmRⅠ、AlmRⅡ和AlmRⅢ）；后修飾基因almN（編碼氨甲酰轉移酶）、almM（編碼黃素依賴的單加氧酶）、almP（編碼P450 加氧酶）和almF（編碼氨基合酶）.我們分別收集培養(yǎng)3、5、7d 的野生型和orf17突變株菌體，提取菌體總RNA，對其進行初步定量后將其反轉錄合成cDNA，并以特異性引物（表2）對其進行擴增.結果顯示（圖3），在發(fā)酵的第3、5、7 天almAI、almN、almK和almP4 個基因在野生型和orf17突變株中均有表達，但突變株中almAⅠ表達量逐漸降低；突變株中almM、almH、almRⅠ基因第3 和5 天有表達，第7 天沒有表達，而這3 個基因在野生型中均有表達；突變株中almF、almRⅡ和almRⅢ基因只在第3 天有表達，而這3 個基因在野生型中均有表達.因此，orf17基因的突變均不同程度的影響了almAI、almF、almRⅡ、almRⅢ、almM、almRⅠ和almH這7 個基因的表達，表明Orf17 可能調控了等7 個基因的表達.Orf17 對這些基因的調 控作用可能是直接的，也可能是間接的.

圖3 RT-PCR 分析格爾德霉素生物合成相關基因在野生型和突變株中的轉錄表達Fig.3 RT-PCR analysis of the transcriptional levels of genes in the geldanamycin gene cluster in the wild-type strain and the orf17 mutant

2.3orf17突變株中產量升高的化合物分析在對orf17突變株進行發(fā)酵產物檢測時，我們發(fā)現(xiàn)orf17突變株中出峰時間在25.2、27.1 min 和29.3 min的化合物（分別命名為化合物1，2 和3）與野生型相比產量明顯提高，并且與格爾德霉素的產量變化相反，說明Orf17 可能對這3 個化合物的生物合成起到負調控作用（圖4）.

圖4 野生型和orf17 突變株中不同發(fā)酵階段化合物1，2，3 的產量Fig.4 The production of compound 1,2,3 in the wide-type strain and the orf17 mutant at different fermentation stage

通過對orf17突變株發(fā)酵產物的分離和純化，我們獲得了這3 個化合物的純品.ESI-MS 分析表明化合物1、1 和3 的相對分子質量分別為1 024、1 038 和1 052（分別基于m/z1 023 [M– H]-、1 061[M+Na]+和1 051 [M– H]-）.1H NMR、13C-DEPT NMR、HSQC、HMBC、1H-1H COSY 和ROESY 分析表明化合物1為洋橄欖葉素（elaiophylin），分子式為C54H88O18；化合物2為11′-o-甲基洋橄欖葉素（11′-o-methylelaiophylin）分子式為C55H90O18，化合物3為11,11′-o-二甲基洋橄欖葉素（11,11′-odimethylelaiophylin），分子式為C56H92O18.3 個化合物 都為洋橄欖葉素及其衍生物.

3 結論和討論

本研究以自溶鏈霉菌為材料，探究其次生代謝產物格爾德霉素生物合成過程中的關鍵基因orf17的功能和調控作用.我們首先構建了orf17突變株，通過HPLC 檢測了野生型和orf17突變株在不同發(fā)酵階段產物的變化.相較野生型而言，orf17突變株中格爾德霉素的產量大幅減少，說明Orf17 在格爾德霉素的生物合成中起正調控作用.為了尋找Orf17 可能調控的靶基因，選取了10 個與格爾德霉素生物合成相關基因almAI、almF、almM、almN、almH、almK、almP、almRⅠ、almRⅡ和almRⅢ，分析了它們在野生型和突變株中的轉錄表達差異.結果顯示almAI、almF、almM、almH、almRⅠ、almRⅡ和almRⅢ這7 個基因的表達受到了orf17突變的影響，說明Orf17 可能對這些基因直接或間接地起到了調控作用.Orf17 蛋白對這些基因的具體調控作用還有待后續(xù)進一步研究.

有趣的是，HPLC 檢測表明，出峰時間在25.2，27.1 min 和29.3 min 的化合物在orf17突變株中產量提高，最終我們分離得到這3 個化合物并進行了結構解析，它們是洋橄欖葉素及其衍生物.這說明Orf17 在正調控格爾德霉素的生物合成的同時，對洋橄欖葉素的生物合成也有負調控作用.這是格爾德霉素生物合成基因簇內的Orf17 能夠調控洋橄欖葉素的生物合成的首次報道.在鏈霉菌中次級代謝物的生物合成往往是被高度調節(jié)的，如果不同的代謝產物生物合成途徑使用共同的前體，那么前體物質的供應可能會對這些途徑產生影響.格爾德霉素生物合成的起始單元為3-氨基-5-羥基苯甲酸（AHBA），其合成起始于葡萄糖.而在洋橄欖葉素的合成過程中，葡萄糖通過磷酸化、dTDP 化、脫水、還原、差向異構化等反應生成2-脫氧-L-巖藻糖，再經糖基轉移酶催化加入到洋橄欖葉素分子中[23].同時，在格爾德霉素和洋橄欖葉素的生物合成中，均以丙二酰輔酶A 和甲基丙二酰輔酶A 為延伸單元.因此，這兩條生物合成途徑之間存在競爭關系.以拮抗模式對它們的生物合成進行調節(jié)，可以在營養(yǎng)物質匱乏期間選擇性合成所需的次級代謝產物來適應性周圍的環(huán)境.Orf17 雖然是一個在特定基因簇內的調控子，但卻是一個多效性調控子，這種不同生物合成途徑的交叉調控，進一步表明鏈霉菌中次生代謝產物生物合成調節(jié)的復雜性和靈活性，也是鏈霉菌能夠更好適應環(huán)境變化的調控機制.本研究讓我們更加深入地了解格爾德霉素的生物合成機制，也為今后通過遺傳手段改造苯醌安莎類抗生素提供了理論依據.