呂曉楠，宗春輝，董 錚

糖尿病腎病(diabetic kidney disease,DKD)是常見(jiàn)的糖尿病微血管并發(fā)癥，也是導(dǎo)致終末期腎病(end-stage renal disease,ESRD)的主要病因之一，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，到2040年糖尿病患者將增至6億，其中約1/3將發(fā)展至DKD[2]。足細(xì)胞是腎小球內(nèi)臟上皮細(xì)胞，是構(gòu)成腎小球?yàn)V過(guò)屏障的重要部分。DKD與糖尿病早期腎小球足細(xì)胞受損密切相關(guān)，其中足突的形態(tài)、數(shù)量、相關(guān)蛋白的表達(dá)等方面的改變與DKD的發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)系[3]。研究發(fā)現(xiàn)，在一定刺激作用下，足細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)的表型變化[4]，而EMT是DKD中發(fā)生纖維化的重要機(jī)制[5]。

中醫(yī)中藥在治療腎臟疾病中具有一定優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)低聚原花青素(Oligoprocyanidins，OPC)具有抗氧化、清除自由基、抗衰老作用。越來(lái)越多的證據(jù)表明，OPC可能對(duì)預(yù)防糖尿病并發(fā)癥具有一定作用[6,7]。本課題組前期證實(shí)了OPC可減少大鼠的氧化應(yīng)激、抑制炎性反應(yīng)[8]。本研究在前期研究基礎(chǔ)上探索OPC對(duì)DKD大鼠的腎臟病理改變和EMT作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 OPC提取物購(gòu)自天津尖峰藥業(yè)有限公司；鏈脲佐菌素 (Streptozotocin,STZ)(美國(guó)Sigma公司)；代謝籠(韓國(guó)JeungdoBio&Plant公司)；RIPA裂解緩沖液(P0013B)，蛋白酶抑制劑混合物(P1005)購(gòu)自上海碧云天公司；一抗抗體TWIST1(CST，1∶1000)、E-cadherin(CST，1∶1000)、Vimentin(CST，1∶1000)蛋白均購(gòu)自Cell signaling公司。葡萄糖、血尿素氮和肌酐試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；尿白蛋白試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bethyl公司。光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本Olympus；超薄切片機(jī)(德國(guó)萊卡)，透射電子顯微鏡(H-7700，日本日立)，環(huán)氧樹(shù)脂Araldite M購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取5周齡雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠30只，體重(180±20)g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供。在22～24 ℃的光/暗循環(huán)中飼養(yǎng)12 h。本研究遵循國(guó)際動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理規(guī)則和準(zhǔn)則。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 DKD造模和治療 SD大鼠隨機(jī)分為3組(每組n=10)：對(duì)照組大鼠給予正常飲食；模型組和OPC組給予高脂高糖飲食4周后，腹腔注射STZ檸檬酸鹽緩沖液(pH=4.5)0.05 μmol/L，50 mg/kg。注射后7 d測(cè)定血糖水平，血糖水平超過(guò)16.7 mmol/L的大鼠為造模成功。

在常規(guī)飼養(yǎng)基礎(chǔ)上，OPC組大鼠每天給予500 mg/kg的OPC灌胃，對(duì)照組和模型組只給予等量的生理鹽水。給藥前后測(cè)定大鼠飲水量和體重。在12周時(shí)，使用代謝籠收集SD大鼠24 h尿液，尾靜脈采取血液樣本。隨后所有大鼠在乙醚麻醉下稱(chēng)重并處死，以獲得腎臟標(biāo)本。

1.3.2 生化指標(biāo)測(cè)定 使用試劑盒測(cè)量大鼠血漿葡萄糖、血尿素氮和肌酐水平，以及尿白蛋白含量。

1.3.3 組織病理學(xué)檢查 將大鼠的50%腎臟放在液氮中冷凍，用于蛋白質(zhì)提取和酶測(cè)定。另50%腎臟制作成2 mm的切片，使用HE和Masson染色評(píng)估腎小球的病理情況。

1.3.4 透射電鏡觀察 取腎皮質(zhì)組織小塊，用2.5%戊二醛固定。然后，用PBS洗滌，用1%四氧化鋨固定。丙酮梯度脫水后，將組織包埋在Araldite M中。用超薄切片機(jī)制作超薄切片，用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色。切片通過(guò)透射電子顯微鏡進(jìn)行檢查。

1.3.5 Western blot分析 腎組織在RIPA裂解緩沖液中裂解，補(bǔ)充完整的蛋白酶抑制劑混合物，然后4 ℃，12 000 r/min，離心30 min。蛋白質(zhì)樣品與緩沖液混合，95～100 ℃加熱30 min。轉(zhuǎn)模后，室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h。檢測(cè)TWIST1、E-cadherin、vimentin蛋白。

2 結(jié) 果

2.1 OPC對(duì)DKD大鼠腎功能和生化指標(biāo)影響 與對(duì)照組相比，模型組大鼠的體重明顯減輕，飲水量增加(P<0.05)。OPC組的體重明顯增加并高于模型組(P<0.05)而飲水量低于模型組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 三組大鼠8周時(shí)的體重和飲水量比較

模型組的血糖、肌酐、血尿素氮和尿蛋白明顯升高，高于對(duì)照組(P<0.05)。OPC干預(yù)后可降低DKD大鼠的血糖、血清肌酐、血尿素氮和尿蛋白水平(P<0.05)，但仍高于正常水平，見(jiàn)表2。

表2 三組大鼠8周時(shí)生化指標(biāo)比較

2.2 OPC對(duì)DKD大鼠腎臟組織的影響 HE染色顯示對(duì)照組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)完整，毛細(xì)血管腔均勻一致，基底膜完整，腎小管排列整齊，大小均勻，腎間質(zhì)未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與對(duì)照組相比，模型組腎小球明顯硬化、萎縮，腎小管明顯擴(kuò)張，間隙增大，腎間質(zhì)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。OPC治療后，腎臟病理現(xiàn)象明顯減輕，腎小球未見(jiàn)明顯萎縮，腎小管擴(kuò)張及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕(圖1)。

觀察大鼠腎臟Masson染色，藍(lán)色區(qū)域代表腎纖維化程度。對(duì)照組大鼠腎間質(zhì)僅有少量藍(lán)色區(qū)域，與對(duì)照組相比，模型組大鼠腎小球、腎小管、腎間質(zhì)均出現(xiàn)大量藍(lán)色區(qū)域，提示腎纖維化嚴(yán)重。OPC組大鼠腎臟藍(lán)色區(qū)域明顯減少，腎小球和腎間質(zhì)有部分染色區(qū)(圖1)。

圖1 OPC對(duì)DKD大鼠腎臟組織病理影響(×200)

2.3 OPC改善DKD大鼠腎組織自噬 對(duì)照組腎臟電鏡圖像示，腎小球足細(xì)胞分布均勻，無(wú)明顯增厚結(jié)構(gòu)。模型組腎小球足細(xì)胞明顯增厚，結(jié)構(gòu)模糊，足細(xì)胞足突變形，不同程度融合，無(wú)自噬空泡。與對(duì)照組相比，OPC組足細(xì)胞增多，但程度較模型組輕，足細(xì)胞足突部分融合，同時(shí)出現(xiàn)自噬空泡(圖2)。

圖2 OPC對(duì)DKD大鼠腎臟組織病理影響(×200)

2.4 OPC對(duì)DKD大鼠腎臟組織中的EMT相關(guān)蛋白的影響 OPC對(duì)DKD大鼠腎組織EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、vimentin和TWIST1蛋白的影響如圖3所示：與對(duì)照組相比，DKD大鼠腎組織中vimentin蛋白和TWIST1蛋白水平增加(P<0.05)，E-cadherin蛋白水平降低(P<0.05)。OPC顯著上調(diào)DKD大鼠E-cadherin蛋白的表達(dá)(P<0.05)，抑制vimentin蛋白和TWIST1蛋白的表達(dá)(P<0.05，表3)。

圖3 OPC對(duì)DKD大鼠腎組織中E-cadherin、vimentin蛋白和TWIST1蛋白表達(dá)的影響

表3 DKD大鼠腎組織中E-cadherin、vimentin蛋白和TWIST1蛋白相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

近年來(lái)EMT在DKD中的作用逐漸被認(rèn)識(shí)，EMT與腎臟纖維化發(fā)生密切相關(guān)[9]。腎臟足細(xì)胞等內(nèi)皮細(xì)胞EMT涉及多種機(jī)制和分子變化，通過(guò)這些變化上足細(xì)胞失去其上皮特性并獲得間質(zhì)細(xì)胞典型特性[10,11]。在成年人中，典型間質(zhì)細(xì)胞的主要功能是通過(guò)分泌細(xì)胞外基質(zhì)來(lái)維持結(jié)構(gòu)完整性，而DKD中EMT發(fā)生是腎臟纖維化發(fā)生的重要原因[12]。因此，抑制EMT可能對(duì)腎臟纖維化的干預(yù)具有一定效果。

本研究發(fā)現(xiàn)，以500 mg /(kg·d)的OPC治療可改善DKD大鼠的腎功能、降低血糖、血清肌酐、尿素氮和尿蛋白水平。更為重要的是，DKD大鼠的組織形態(tài)學(xué)變化得到明顯改善。既往也有研究證實(shí)OPC的類(lèi)似治療效果，發(fā)現(xiàn)在OPC干預(yù)后可改善糖尿病大鼠的腎臟損傷、尿蛋白定量、腎臟肥大指數(shù)活性顯著降低[13]。在嚴(yán)重的T2DM模型中也報(bào)道了相同的OPC治療作用，并改善胰腺β細(xì)胞的功能、血糖和胰島素抵抗水平[14]。

目前認(rèn)為，氧化應(yīng)激也在DKD疾病的發(fā)展中起著重要作用，因此，也成為DKD預(yù)防及治療的潛在的靶標(biāo)[15]。OPC是近年來(lái)抗氧化和炎癥作用研究較為廣泛的中草藥，已經(jīng)被廣泛用于多種疾病的治療[16]。OPC的氧化還原平衡能力和炎癥調(diào)節(jié)作用，可能是改善DKD疾病嚴(yán)重程度的重要基礎(chǔ)。Stohs等[17]使用OPC的提取物干預(yù)糖尿病大鼠發(fā)現(xiàn)，干預(yù)后可明顯升高大鼠的胰島素，同時(shí)降低其HbA1c水平，并可以調(diào)節(jié)血清脂質(zhì)。足細(xì)胞是腎臟的固有細(xì)胞，也是腎小球最脆弱的細(xì)胞成分。足細(xì)胞可通過(guò)肌動(dòng)蛋白控制的細(xì)胞骨架系統(tǒng)和足細(xì)胞特異表達(dá)的蛋白質(zhì)分子，在腎小球的結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮重要作用。目前認(rèn)為，足細(xì)胞損傷是腎病蛋白尿和腎小球硬化的主要原因[18]。據(jù)報(bào)道，OPC通過(guò)抑制NF-κBp-p65體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)改善大鼠的腎臟纖維化程度[19]，這可能是OPC改善DKD大鼠足細(xì)胞EMT的原因。

有研究表明，腎臟組織在高血糖的環(huán)境中會(huì)改變腎小球系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞和骨髓來(lái)源的祖細(xì)胞等正常的非成纖維細(xì)胞腎細(xì)胞的表型[20]。而實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)胞因子、高血糖和晚期糖基化終產(chǎn)物通過(guò)成肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和EMT的過(guò)程誘導(dǎo)腎細(xì)胞表型的纖維化變化[21]。足細(xì)胞是內(nèi)臟上皮細(xì)胞，當(dāng)其發(fā)生EMT時(shí)會(huì)失去成熟足細(xì)胞的上皮樣表型標(biāo)記物，例如E-cadherin蛋白，并上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞樣表型標(biāo)記物，例如Vimentin和TWIST1蛋白。本研究通過(guò)Western blot分析發(fā)現(xiàn)，OPC可上調(diào)DKD大鼠E-cadherin蛋白的水平，并下調(diào)Vimentin和TWIST1蛋白的水平。而需要指出的是通過(guò)電鏡觀察，OPC治療后可改善DKD大鼠的腎臟組織中足細(xì)胞足突部分融合，并觀察到自噬泡出現(xiàn)。因此，可以推測(cè)足細(xì)胞自噬水平的增加可能與改善足細(xì)胞EMT存在一定關(guān)系，OPC在體內(nèi)外可通過(guò)調(diào)節(jié)DKD大鼠足細(xì)胞自噬，抑制EMT的發(fā)生，這可能對(duì)今后DKD纖維化等其他并發(fā)癥的治療提供新的選擇，是我們今后的研究方向。