裴美娟，孫中磊，黃生炫，劉英富，李學(xué)文

腦膠質(zhì)瘤是一種高侵襲性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，與其他神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤相比，腦膠質(zhì)瘤有更高的轉(zhuǎn)移趨勢(shì)，整體預(yù)后較差及生存率較低[1,2]。目前，腦膠質(zhì)瘤缺乏合適的治療靶點(diǎn)，因此，臨床迫切需要發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤的致癌機(jī)制和新型靶向療法。近年來，越來越多的證據(jù)表明，Hippo/YAP信號(hào)通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和腦腫瘤中有重要作用[3]，耗竭YAP或藥物抑制YAP可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡和細(xì)胞生長(zhǎng)抑制[4]。有研究表明，RNF181可以穩(wěn)定YAP蛋白并抑制K48連接的多聚泛素化，從而導(dǎo)致乳腺癌的進(jìn)展[5]。RNF181作為E3泛素連接酶可以抑制抗原受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到CARD11下游NF-κB信號(hào)通路負(fù)調(diào)控淋巴瘤細(xì)胞生存[6]，但關(guān)于RNF181在腦膠質(zhì)瘤中的功能報(bào)道較少。本研究通過探究RNF181與Hippo/YAP對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性度的影響及其可能機(jī)制，旨在為臨床診治提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SHG-44(上海中科院細(xì)胞庫)，DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰酶(美國(guó)Gibco公司)，過表達(dá)RNF181mRNA腺病毒表達(dá)載體AAVrh.10 RNF181與無表達(dá)基因腺病毒衣殼AAVrh.10 Negative(濟(jì)南思科生物科技有限公司)，RNF181、YAP(美國(guó)abcam公司)，MTT、Trizol及去RNA酶試劑(美國(guó)Cayman Chemical公司)，RT-PCR引物(賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司)。Tranwell小室、細(xì)胞培養(yǎng)板及計(jì)數(shù)板(美國(guó)康寧公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞與分組 SHG-44細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，分為3組：對(duì)照組(Control組)、陰性對(duì)照組(Negative組)和RNF181過表達(dá)組(RNF181組)。Negative組和RNF181組SHG-44細(xì)胞分別加入等滴度純化的腺病毒表達(dá)載體AAVrh.10 Negative、AAVrh.10 RNF181，Control組加入等體積PBS，共培養(yǎng)12 h。根據(jù)細(xì)胞的密度進(jìn)行換液或者傳代。每次傳代時(shí)，加入2.5 μg/ml嘌呤霉素繼續(xù)篩選穩(wěn)定的細(xì)胞株，每隔1 d于熒光顯微鏡觀察細(xì)胞GFP熒光強(qiáng)度，直至熒光強(qiáng)度無明顯變化，無死亡漂浮的細(xì)胞。將一部分細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，其余冷凍保存。

1.2.2 RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 使用Trizol試劑盒提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA鏈，利用Real-timePCR試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)各蛋白mNRA的表達(dá)，GAPDH作為內(nèi)參。引物序列如表1。

表1 各蛋白基因引物序列

1.2.3 MTT試驗(yàn) 取細(xì)胞懸液100 μl在有完全培養(yǎng)液的96孔板中培養(yǎng)至 2×105/孔(37 ℃、5%CO2)。用20 μl的MTT處理后，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加150 μl DMSO終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在490 nm 處的吸光值。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn) 利用無血清DMEM培養(yǎng)液重懸各組細(xì)胞至1×104/ml，取200 μl加入Transwell小室中，并將盛有細(xì)胞懸液的Transwell小室置于含有培養(yǎng)液的實(shí)驗(yàn)孔中培養(yǎng)24 h；取出后，PBS清洗，用棉簽擦去小室結(jié)晶紫染色薄膜下層細(xì)胞后，置于顯微鏡下計(jì)數(shù)拍照。

1.2.5 Western blot檢測(cè) 轉(zhuǎn)染72 h后，取各組細(xì)胞破碎提取蛋白質(zhì)。常規(guī)電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)膜。10%脫脂奶粉4 ℃封閉1 h，然后在含一抗的10%脫脂奶粉的TBST緩沖液過夜： RNF181(1∶1000)、Hippo(1∶1000)、YAP(1∶1000)和GAPDH(1∶1000)。二抗孵育后ECL plus檢測(cè)信號(hào)，Image J軟件定量分析。

1.2.6 免疫熒光檢測(cè) 將細(xì)胞接種到培養(yǎng)玻片上，用4%多聚甲醛固定，并用0.1%Triton X-100透化。封閉后按照常規(guī)方法進(jìn)行染色，將細(xì)胞與一抗GFAP(1∶2000)、RNF181(1∶2000)和抗YAP(1∶2000)抗體孵育，其中熒光共定位檢測(cè)RNF181與YAP抗體同時(shí)加入樣本，然后與二抗孵育，通過用DAPI染色細(xì)胞核。熒光顯微鏡掃描后Image J軟件用于定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (1)轉(zhuǎn)染后SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞過表達(dá)RNF181：與對(duì)照組和Negative組相比，膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SHG-44中RNF181 mRNA及蛋白表達(dá)量均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05，表2)。(2)RNF181過表達(dá)促進(jìn)Hippo/YAP表達(dá)：與對(duì)照組和Negative組相比，RNF181過表達(dá)組YAP mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 SHG44細(xì)胞3組實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

2.2 RNF181過表達(dá)促進(jìn)SHG-44細(xì)胞增殖、遷移和侵襲 實(shí)驗(yàn)72 h MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 與對(duì)照組和Negative組細(xì)胞增殖率相比，RNF181過表達(dá)組細(xì)胞增殖率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。免疫熒光結(jié)果顯示，與對(duì)照組和Negative組細(xì)胞數(shù)相比，RNF181過表達(dá)組細(xì)胞數(shù)明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1，表3)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組和Negative組穿膜細(xì)胞數(shù)相比，RNF181過表達(dá)組的SHG-44穿膜細(xì)胞數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2，表3)。

表3 3組RNF181過表達(dá)促進(jìn)SHG-44細(xì)胞增殖、遷移和侵襲結(jié)果比較

圖1 SHG-44細(xì)胞免疫熒光(×200)

圖2 SHG-44細(xì)胞transwell(×200)

2.3 RNF181與YAP蛋白共表達(dá) 免疫熒光共定位染色顯示，SHG-44細(xì)胞中YAP和RNF181共定位于細(xì)胞核內(nèi)(圖3)。

圖3 RNF181與YAP蛋白共表達(dá)(×200)

3 討 論

腦膠質(zhì)瘤是最危及生命的原發(fā)性腦腫瘤之一，其發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)涉及抑癌基因和致癌基因間平衡的多步驟過程，受到多基因的調(diào)控[7]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，RNF181過表達(dá)能顯著提高Hippo/YAP信號(hào)的表達(dá)，提高SHG-44的增殖能力與惡性度。與既往研究一致，YAP在人腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)上調(diào)，與患者預(yù)后惡化相關(guān)[8]。并且，通過免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)，本研究還發(fā)現(xiàn)RNF181與YAP共表達(dá)于細(xì)胞核中。因此，本研究推測(cè)RNF181過表達(dá)可能是腦膠質(zhì)瘤Hippo/YAP信號(hào)激活的啟動(dòng)機(jī)制，RNF181可能作為腦膠質(zhì)瘤治療和診斷的新靶點(diǎn)。

Hippo信號(hào)通路從黑腹果蠅到哺乳動(dòng)物高度保守，在器官大小控制、組織再生和腫瘤抑制等方面發(fā)揮重要作用，YAP是一種重要的轉(zhuǎn)錄共激活因子，受Hippo信號(hào)通路負(fù)調(diào)控[9]。Hippo信號(hào)通路也受到各種上游調(diào)控因子的調(diào)控，如細(xì)胞極性、黏附蛋白和其他信號(hào)通路(Wnt/β-catenin、Notch和MAPK通路)[8]。大量研究表明，Hippo/YAP信號(hào)對(duì)有些腫瘤有重要的致癌作用[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，YAP表達(dá)提高后SHG-44的增殖和侵襲能力明顯增強(qiáng)。還有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠模型中YAP被激活可能導(dǎo)致肝癌和肺癌[11]。此外，YAP被證明可介導(dǎo)幾種與癌癥相關(guān)的表型，包括遷移、侵襲、抗凋亡和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[12]。并且近年來，越來越多的證據(jù)表明，Hippo/YAP信號(hào)通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和腦腫瘤(包括膠質(zhì)瘤)中發(fā)揮著重要作用[10]。因此，本研究結(jié)果提示YAP在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中至關(guān)重要，針對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的YAP靶點(diǎn)可能是一個(gè)很有前途的方向。

RNF181屬于RING家族E3連接酶家族，而RING域負(fù)責(zé)E3連接功能，多種生理功能需要RNF181。 有研究發(fā)現(xiàn)，RNF181在幾種人類惡性腫瘤中升高，RNF181可以與CARD11相互作用，并促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞中的NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)[13]。此外，RNF181被證明可以促進(jìn)結(jié)腸癌的生存能力和血管生成[14]。本研究證明了在膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)RNF181促進(jìn)YAP蛋白表達(dá)，然而抑制RNF181 對(duì)YAP蛋白及膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用仍不清楚，能否應(yīng)用于腦膠質(zhì)瘤臨床治療還有待研究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，RNF181可以通過非蛋白水解的方式穩(wěn)定YAP蛋白，促進(jìn)Hippo/YAP信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)膠質(zhì)瘤中的細(xì)胞增殖和遷移，這可能為泛素修飾在YAP蛋白和 Hippo信號(hào)傳導(dǎo)中的作用提供新見解，為腦膠質(zhì)瘤的臨床治療提供新的方向。