朱學棟，許 攀，張曉芳，朱菲菲，何曉蓉

（重慶市渝東南農(nóng)業(yè)科學院，重慶 400800）

淫羊藿是我國傳統(tǒng)大宗中藥材，為小檗科淫羊藿屬多年生常綠草本植物。地上干燥部分入藥，其主要化學成分為多種黃酮類有機化合物、木脂素、生物堿、揮發(fā)油等。具有調(diào)節(jié)人體內(nèi)激素分泌、增強人體自身細胞免疫能力等重要生理作用[1-2]，廣泛用于補腎壯陽、強壯筋骨、祛寒散濕等方面，現(xiàn)代中醫(yī)藥研究表明，淫羊藿具有良好的保健、抗癌抗腫瘤效果[3]。全球淫羊藿屬植物約56 種，我國約47 種[4]，占全世界淫羊藿屬植物資源的83.93%，因此，我國是淫羊藿種質(zhì)資源最豐富的國家，也是該屬植物的現(xiàn)代地理分布中心。但《中國藥典》規(guī)定藥用淫羊藿品種僅為心葉淫羊藿、箭葉淫羊藿、柔毛淫羊藿、朝鮮淫羊藿和巫山淫羊藿的地上干燥部分[5]。其中，心葉淫羊藿、箭葉淫羊藿、柔毛淫羊藿、朝鮮淫羊藿植物總黃酮含量一般不低于5.0%，淫羊藿苷含量不得低于0.5%；巫山淫羊藿朝藿定C 成分含量一般不低于1.0%。我國淫羊藿產(chǎn)區(qū)現(xiàn)階段還主要以野生資源為主，隨著淫羊藿需求量大增，藥民采用連根拔起的方式挖掘，導致野生資源銳減，質(zhì)量參差不齊，在臨床用藥方面極不規(guī)范。

中藥材指紋圖譜能有效識別藥材的真?zhèn)位虍a(chǎn)地，通過其主要特征峰的面積大小或比例限定，能有效控制藥材質(zhì)量。因此，筆者以重慶三峽庫區(qū)的野生淫羊藿種質(zhì)資源為研究對象，通過液相色譜峰的保留時間和峰面積構建當?shù)匾吧蜣椒N質(zhì)資源的指紋圖譜，為庫區(qū)淫羊藿種質(zhì)資源的開發(fā)利用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試中藥材供試中藥材種類為淫羊藿，主要收集于重慶三峽庫區(qū)，共20份淫羊藿野生種質(zhì)資源（詳見表1）。

1.1.2 試驗儀器Agilent 1260 高效液相色譜儀 （包括：真空脫氣機、二元泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD 檢測器，美國），KQ2200DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），F(xiàn)A114 萬分之一電子天平（上海豪晟科學儀器有限公司）。

1.1.3 試 劑淫羊藿苷對照品（批號：PCS-190218，購于北京世紀奧科生物技術有限公司，質(zhì)量分數(shù)≥98%）；乙腈（色譜純，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆?；乙醇、甲醇（色譜純，成都市科隆化學品有限公司）；流動相用水為實驗室純水機制取超純水（賽默飛Direct-Qr3UV）。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-水（30 ∶70）為流動相，檢測波長為270 nm，進樣量10 μL。

1.2.2 對照品溶液的制備取淫羊藿苷標準品適量，精確稱量，加甲醇溶液制成0.1 mg/mL 的對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備取供試品粉末（過50 目篩）0.2 g，精密稱定，轉(zhuǎn)移到帶塞錐形瓶中，加入稀乙醇溶液20 mL，稱定重量，超聲處理1 h，再稱定濾液重量，用稀乙醇補足缺失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

1.2.4 方法學考察（1）精密度試驗：精密吸取同一供試樣品，按照1.2.1 色譜條件進行方法精密度測定，連續(xù)進樣5 次，考察保留時間和峰面積，計算RSD。（2）穩(wěn)定性試驗：精密吸取同一供試樣品，按照1.2.1 色譜條件進行方法穩(wěn)定性測試，樣品分別放置1、2、4、8、24 h 后依次進樣，分別考察保留時間和峰面積，計算得出RSD。（3）復性試驗：按照1.2.3 制備5 份供試樣品，再按照1.2.1的檢測方法檢測保留時間和峰面積，計算RSD。

1.2.5 主成分分析與聚類分析（1）主成分分析：以淫羊藿內(nèi)含有機化合物的峰面積大小為主要變量，利用SPSS 統(tǒng)計分析軟件對淫羊藿主成分進行分析。（2）聚類分析：通過SPSS 統(tǒng)計軟件中Ward 聯(lián)接聚類方法，利用 Euclidean 等距離測量分析技術，對20 份淫羊藿樣品的液相色譜數(shù)據(jù)進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學考察結(jié)果

精密度試驗結(jié)果顯示，RSD 為0.87%，小于3%，表明該方法精密度良好，符合指紋圖譜構建的相關技術要求。穩(wěn)定性試驗結(jié)果顯示，RSD為1.01%，小于3%，說明樣品穩(wěn)定性良好，符合指紋圖譜構建的相關技術要求。重復性試驗結(jié)果顯示，RSD 小于3%，表明該方法重復性良好，符合指紋圖譜構建的相關技術要求。

2.2 指紋圖譜構建

由表2 可知，峰面積RSD 差異較大，從1～11 號峰的RSD 分別為5.06%、249.2%、161.9%、80.1%、52.5%、57.7%、91.9%、138.1%、126.5%、62.8% 和117.1%，其中，2 號峰的RSD 最大，1 號峰RSD 最小。這表明不同品種不同地點收集的淫羊藿種質(zhì)資源具有較大的差異性；其中1、4、5、6、8、9、10、11 號峰為20 份種質(zhì)資源的共有峰。

表2 不同批次淫羊藿種質(zhì)資源的峰面積

2.3 主成分分析與聚類分析

2.3.1 主成分分析如圖1 所示，20 份淫羊藿種質(zhì)資源中共檢測出11 種成分，其中有4 個峰貢獻率較大，特征值均超過1。

圖1 20 份淫羊藿種質(zhì)資源主成分分析結(jié)果

2.3.2 聚類分析聚類結(jié)果如圖2 所示，20 份淫羊藿主要可分為3 大類，第一類為編號3、20、15、1、12、2、6 的樣品，第2 類為編號8、14、7、4、5、9、10、11、13 的樣品，第3 類為編號17、18、19、16 的樣品。

圖2 20 份淫羊藿種質(zhì)資源聚類分析結(jié)果

3 結(jié) 論

通過收集重慶本地淫羊藿野生種質(zhì)資源，以淫羊藿苷為標樣，按照《中國藥典》標準進行洗脫分離，該方法穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。構建得到重慶地區(qū)淫羊藿HPLC 指紋圖譜。結(jié)果表明，不同收集地點，不同品種淫羊藿藥材差異性較大，同一地點，同一品種之間相似性較高，且各品種之間有效藥用成分含量差異大，同品種不同地點有效成分含量也有存在較大的差異性。因此，不同淫羊藿種質(zhì)資源，通過更多優(yōu)良的特異性狀來區(qū)別對待[6]。通過指紋圖譜建立，為更好地控制淫羊藿中藥材內(nèi)在質(zhì)量提供科學依據(jù)，逐步規(guī)范淫羊藿用藥，保護淫羊藿野生種質(zhì)資源。