李志鴻， 葉學(xué)勁， 劉經(jīng)鵬， 陳文陽， 滕居贊

（1.廣州市荔灣區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，廣東廣州510000；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧530011；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西南寧530000）

骨折常導(dǎo)致骨折不愈合[1-2]。中醫(yī)學(xué)將骨折治則分為三期，骨折中期相當(dāng)于原始骨痂形成期，此期的特點(diǎn)是腫痛較前期減輕，但瘀腫尚未消盡，筋骨雖連而未堅(jiān)，故此期宜和營生新、接骨續(xù)損。骨折的愈合是從修復(fù)過程的起始直至骨折最終塑形完成為止的一個(gè)連續(xù)不斷的過程。而骨折中期是連接初、后期的一個(gè)必不可少的“樞紐”。一旦骨折中期愈合欠佳，將會導(dǎo)致骨折初期治療盡棄，而骨折后期過程停滯，最終導(dǎo)致骨折不愈合。骨折中期治療常用的代表中藥為當(dāng)歸、骨碎補(bǔ)[3]。當(dāng)歸始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為傘形科多年生草本植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根，有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸的作用。骨碎補(bǔ)始載于《藥性本草》，為水龍骨科多年附生蕨類植物槲蕨Drynaria fortune（Kunze）J.SM.的干燥根莖，其功效主要為活血續(xù)傷、補(bǔ)腎強(qiáng)骨。當(dāng)歸、骨碎補(bǔ)對推進(jìn)骨折愈合進(jìn)程有明顯的作用[4]，骨折的愈合與血液供應(yīng)、骨膜完整性破環(huán)程度、斷端的接觸、周圍肌群的影響相關(guān)。中藥因其成分復(fù)雜，對其有效成分的研究開展受限，而中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)則可從中藥的化合物-靶向-疾病關(guān)系反映、闡述其之間的相互作用。本研究系統(tǒng)性運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法綜合探討當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)可能的化合物構(gòu)成，并分析當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)配伍治療骨折三期辨證中期可能的藥理學(xué)機(jī)制，以期為下一步的藥物基礎(chǔ)研究提供參考，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)的化學(xué)成分借助中藥系統(tǒng)藥理 學(xué) 分 析 平 臺（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）分別檢索當(dāng)歸、骨碎補(bǔ)的所有化學(xué)成分，以口服生物利用度（OB）≥30%[5]，類藥性（DL）≥0.18[6]為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選當(dāng)歸、骨碎補(bǔ)中的活性成分，最后得到當(dāng)歸2個(gè)、骨碎補(bǔ)18個(gè)化合物。

1.2 當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將通過TCMSP平臺按照篩選標(biāo)準(zhǔn)所得的當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)的20個(gè)化合物及其258個(gè)靶點(diǎn)，應(yīng)用Cytoscape3.7.1開放源碼的生物信息分析軟件構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫10.5線上軟件（http：//string-db.org），將篩選所得的當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)靶點(diǎn)上傳，選擇智人種（homo sapiens），應(yīng)用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 閉合骨折相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建基于CTD（https：//ctdbase.org）和GeneCards（https：//www.genecards.org）數(shù)據(jù)庫綜合篩選挖掘閉合骨折相關(guān)靶點(diǎn)，構(gòu)建閉合骨折相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫，與當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)化合物靶點(diǎn)進(jìn)行對比分析，篩選出當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)作用于閉合骨折的靶點(diǎn)，應(yīng)用Venny 2.1在線工具（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/）繪制韋恩圖。

1.5 當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)化合物靶點(diǎn)與閉合骨折相關(guān)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建根據(jù)當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)化學(xué)成分-靶點(diǎn)預(yù)測結(jié)果和靶點(diǎn)-疾病預(yù)測結(jié)果，應(yīng)用Cytoscape 3.7.1軟件中的“Merge”功能，將2個(gè)預(yù)測結(jié)果合并成“化學(xué)成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)行全局化可視網(wǎng)絡(luò)分析。通過Network Analysis功能計(jì)算網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋮?shù)，分析其相互關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 有效化合物的篩選本研究搜索到化合物共196個(gè)，其中，當(dāng)歸化合物125個(gè)，骨碎補(bǔ)71個(gè)。最后篩選得到當(dāng)歸2個(gè)、骨碎補(bǔ)18個(gè)化合物，主要活性成分的OB和DL值見表1。

表1 當(dāng)歸、骨碎補(bǔ)主要有效化合物信息Table 1 Data of main effective constituents from Radix Angelicae Sinensis and Rhizoma Drynariae

2.2 當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)化學(xué)成分潛在靶點(diǎn)預(yù)測及相互作用篩選當(dāng)歸、骨碎補(bǔ)化合物的有效靶點(diǎn)共258個(gè)，構(gòu)建“化合物成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)化合物靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)見圖2。

圖1 當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Figure 1 Radix Angelicae Sinensis-Rhizoma Drynariae constituent-target network

圖2 當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Figure 2 Target protein interaction network of Radix Angelicae Sinensis-Rhizoma Drynariae

2.3 閉合骨折相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建以“Closed Fracture”或“Fracture Closed”作為關(guān)鍵詞在CTD、GeneCards數(shù)據(jù)庫中查詢，初步篩選出CTD數(shù)據(jù)庫72個(gè)，GeneCards數(shù)據(jù)庫2 950個(gè)，共3 022個(gè)候選基因。根據(jù)“Reference Count”值取GeneCards數(shù)據(jù)庫中相關(guān)度最高的前200個(gè)結(jié)果，其中與閉合骨折靶點(diǎn)有25個(gè)重合，分別為VEGFA、RB1、PPARG、MET、ESR1、CA2、AR、MMP2、IL-6、TP53、VCAM1、PTGS2、NOS2、ABCC1、MAPK3、MAPK1等。當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)靶點(diǎn)與閉合骨折靶點(diǎn)的韋恩圖，見圖3。當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)對閉合骨折作用靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，見圖4。當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)化合物-靶點(diǎn)-閉合骨折的全局性網(wǎng)絡(luò)，見圖5。

圖3 當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)靶點(diǎn)與閉合骨折靶點(diǎn)的韋恩圖Figure 3 Venn diagram of targets related with Radix Angelicae Sinensis-Rhizoma Drynariae and closed fracture

圖4 當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)對閉合骨折作用靶點(diǎn)蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)Figure 4 Interaction network of target proteins of Radix Angelicae Sinensis-Rhizoma Drynariae for closed fracture

圖5 當(dāng)歸-骨碎化合物-靶點(diǎn)-閉合骨折網(wǎng)絡(luò)圖Figure 5 Radix Angelicae Sinensis-Rhizoma Drynariae constituent-target-closed fracture network

2.4 當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)對閉合骨折作用靶點(diǎn)的京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析和基因本體論（GO）分析將當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)對閉合骨折的25個(gè)作用靶點(diǎn)上傳ClueGO插件中進(jìn)行GO分析，GO分析注釋圖見圖6~8。得出111個(gè)生物學(xué)過程（biological process，BP），包括：對雌激素的反應(yīng)（response to estrogen），對缺氧的反應(yīng)（response to hypoxia），轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)，NDA模板化（positive regulation of transcription，DNA-templated），細(xì)胞對缺氧的反應(yīng)（cellular response to hypoxia）等；19個(gè)細(xì)胞組成（cellular component，CC），包括細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷（caveola）、細(xì)胞外空隙（extracellular space）、細(xì)胞質(zhì)（cytosol）等。24個(gè)分子功能（molecular function，MF），包括：酶結(jié)合（enzyme binding）、血紅素結(jié)合（heme binding）、轉(zhuǎn)錄因子逆結(jié)合（transcription factor binding）、相同的蛋白結(jié)合（identical protein binding）等。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)作用于閉合骨折的靶點(diǎn)的通路有51條，主要包括：癌 癥 通 路（pathways in cancer）、膀 胱癌（bladder cancer）、低氧誘導(dǎo)因 子1信號通路（HIF-1 signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路（PI3K/Akt signaling pathway）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）信號通路（VEGF signaling patway）等等，見圖9。

圖6 當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)對閉合骨折作用靶點(diǎn)的GO分析Figure 6 GO analysis results for the targets of Radix Angelicae Sinensis-Rhizoma Drynariae for closed fracture

圖7 當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)對閉合骨折作用靶點(diǎn)的GO分析結(jié)果（P＜0.05）Figure 7 GO analysis results for the targets of Radix Angelicae Sinensis-Rhizoma Drynariae for closed fracture（P＜0.05）

圖8 當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)治療閉合骨折靶點(diǎn)的GO分析結(jié)果餅狀圖（P＜0.05）Figure 8 Pie chart of targets of Radix Angelicae Sinensis-Rhizoma Drynariae for closed fracture by GO analysis（P＜0.05）

圖9 當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)對閉合骨折作用靶點(diǎn)的KEGG分析的氣泡圖Figure 9 Bubble diagram for targets of Radix Angelicae Sinensis-Rhizoma Drynariae for closed fracture by KEGG analysis

3 討論

骨折屬于中醫(yī)學(xué)“骨折病”的范疇?！墩w類要》指出：“肢體損傷外，則氣血傷于內(nèi)，營衛(wèi)有所不貫，臟腑由之不和?！遍_創(chuàng)了“氣血學(xué)說”和“平補(bǔ)法”的理論基礎(chǔ)，主張以補(bǔ)氣血、活血、補(bǔ)肝腎為主的治法。當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)作為骨折三期辨證中期治療常用的藥物配伍，其臨床療效肯定?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，當(dāng)歸具有抗凝血、止血[7]，改善血液循環(huán)[8]，促進(jìn)造血[9]的作用；骨碎補(bǔ)具有促進(jìn)成骨細(xì)胞生成[10]、礦化[11]，促進(jìn)骨折愈合[12]的作用。但目前國內(nèi)對當(dāng)歸、骨碎補(bǔ)促進(jìn)骨折愈合機(jī)制的研究多局限在當(dāng)歸多糖、當(dāng)歸提取物，骨碎補(bǔ)總黃酮[13-14]、骨碎補(bǔ)提取物這一類化合物，且對當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)在骨折愈合的體內(nèi)代謝作用機(jī)制研究鮮見。故本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)配伍治療骨折三期辨證中期的機(jī)制進(jìn)行可能性推斷。

本研究篩選最后得到當(dāng)歸2個(gè)、骨碎補(bǔ)18個(gè)化合物。其中：β-谷甾醇（beta-sitosterol）可能通過改變體外成骨活性而改善骨脆性和骨折形態(tài)[15]。山柰酚（kaempferol）能抑制破骨細(xì)胞分化并促進(jìn)其凋亡，促進(jìn)骨細(xì)胞樣MG-63細(xì)胞系的分化，并減弱TNF在MC3T3-E1小鼠成骨細(xì)胞系中的信號傳導(dǎo)[16]，亦可通過促進(jìn)成骨細(xì)胞功能和抑制骨髓中的脂肪細(xì)胞形成來預(yù)防去卵巢大鼠模型誘導(dǎo)的骨質(zhì)流失[17]。柚皮素（naringenin）可作為超氧化物清除劑，有助于內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)保護(hù)骨骼免受骨質(zhì)疏松癥的侵害，而含有柚皮素的假蒟（Piper sarmentosum）的提取物則具有抑制脂肪組織和骨中11β-羥基類固醇脫氫酶1（11β-HSD1）表達(dá)和活性能力，從而恢復(fù)骨骼結(jié)構(gòu)和強(qiáng)度[18]。木犀草素（luteolin）可以通過促進(jìn)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥中的成骨細(xì)胞分化、礦化和增殖來增加骨形成，其通過抑制活性氧（ROS）的過度生成來抑制成骨細(xì)胞增殖，增強(qiáng)成骨標(biāo)志物的表達(dá)以促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和增加骨保護(hù)素（OPG）/核因子κB受體活化因子配體（RANKL）比率以維持骨量，從而減弱成骨細(xì)胞凋亡。此外，木犀草素可增強(qiáng)OPG/RANKL比率和成骨細(xì)胞分化減輕糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥[19]。本研究分析結(jié)果表明，當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)化合物主要以甾醇類、黃酮類為主，且與目前現(xiàn)有研究結(jié)果一致。此外，還包括黃烷酮類（flavanones）、固醇類（stigmasterols）、海州骨碎補(bǔ)苷（marioside_qt）等。

對當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)對閉合骨折的25個(gè)作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析，涉及111個(gè)生物學(xué)過程、19個(gè)細(xì)胞組成、24個(gè)分子功能。KEGG通路富集發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)作用于閉合骨折的通路有51條，主要明確涉及HIF-1信號通路、TNF信號通路、PI3K/Akt信號通路、VEGF信號通路等。氧供是影響骨折愈合的重要因素，HIF-1在調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用，研究[20]發(fā)現(xiàn)，缺氧條件下MC3T3-E1小鼠成骨細(xì)胞活力下降，HIF-1α蛋白表達(dá)增加，HIF-1α轉(zhuǎn)染的MC3T3-E1細(xì)胞的存活率高于未強(qiáng)制表達(dá)HIF-1α的細(xì)胞，HIF-1α在MC3T3-E1細(xì)胞系中的強(qiáng)制表達(dá)通過抑制細(xì)胞凋亡減弱了缺氧誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞活力下降。TNF-α在干細(xì)胞向成骨分化過程中扮演著雙重角色（促進(jìn)或抑制成骨分化），而TNF-α的作用時(shí)間，作用濃度及作用的干細(xì)胞類型又可能是決定其促進(jìn)或抑制干細(xì)胞成骨分化的主要因素[21]。PI3K/Akt信號通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、存活、遷移和代謝過程的最為重要的一個(gè)信號通路。越來越多的證據(jù)表明，骨組織中的許多信號分子能夠選擇性激活PI3K/Akt信號通路的相關(guān)基因，通過調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活動，破壞骨重建過程中骨形成與骨吸收的動態(tài)平衡[22]。miR-28-3p可以通過活化PI3K/Akt信號途徑而加速骨折愈合過程[23]。miR-181a/b-1通過調(diào)節(jié)第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物基因（PTEN）/PI3K/Akt軸和線粒體代謝促進(jìn)骨生成[24]。VEGF是一種重要的信號蛋白，參與血管生成（胚胎循環(huán)系統(tǒng)的新生形成）和血管生成（從已存在的血管系統(tǒng)中生長血管）。研究[25]表明，骨碎補(bǔ)可通過激活VEGF/VEGFRs的表達(dá)，促進(jìn)骨折愈合。早期骨質(zhì)疏松細(xì)胞（Osterix+）的VEGFA，但不是成熟的成骨細(xì)胞/骨細(xì)胞（Dmp1+），對于快速骨膜血管生成和編織骨形成的骨損傷時(shí)至關(guān)重要。而在損傷時(shí)需要來自另一種細(xì)胞來源而非來自成骨細(xì)胞譜系的VEGFA，以獲得最大的皮質(zhì)缺損髓內(nèi)血管生成和骨生成[26]。因此，預(yù)測當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)可能通過調(diào)控HIF-1、TNF、PI3K/Akt、VEGF等信號通路促進(jìn)骨折三期辨證中期的愈合。

綜上所述，本研究以當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)主要活性成分為研究對象，借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過分析其主要的活性成分，構(gòu)建“化合物-靶向-疾病”的關(guān)系，初步在分子層面展示了當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)作用于骨折三期辨證中期的機(jī)制，且大部分預(yù)測結(jié)果與現(xiàn)代藥理學(xué)研究相符，為科學(xué)用藥提供了指導(dǎo)；然而，本研究僅在分子水平初步預(yù)測當(dāng)歸-骨碎補(bǔ)的作用機(jī)制，缺乏入血移行成分預(yù)測，且缺乏藥物相互作用機(jī)制研究，具有一定的局限性，因此，有待進(jìn)一步加以理論完善以及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。